Исследование микробиоты стекловидного тела у пациентов с диабетическим макулярным отеком (первые результаты)

    Актуальность

    Микробиом человека отличается невероятной сложностью состава и изобилием его взаимодействий с организмом [1]. Как известно, концентрации отдельных представителей микробиоты не являются независимыми друг от друга – они связаны сложной сетью симбиотических и антагонистических взаимодействий. Кроме того, в результате своей жизнедеятельности представители микробиоты способны секретировать такие сигнальные вещества, как серотонин, гистамин, гамма-аминомасляная кислота, ацетилхолин, дофамин и норадреналин.

    Важную роль в регуляции активности иммунной системы играют синтезируемые микроорганизмами лиганды рецепторов врожденного и адаптивного иммунитета [2].

    Продуцируемые отдельными представителями микробиоты короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) осуществляют ингибирование деацетилаз гистонов, что оказывает противовоспалительный эффект: в результате их действия снижается уровень транскрипции, уменьшается уровень фактора некроза опухолей α и происходит индукция созревания FoxP3+Treg-клеток. Также КЦЖК являются специфичными лигандами ряда ассоциированных с G-белками рецепторов – GPR41, GPR43 и GPR109А.

    Через эти рецепторы осуществляется регулировка созревания и фукционирование микроглии, дендритных клеток и Т reg-клеток [3, 4]. Понимая важную роль представителей микробиоты, можно предположить, что при увеличении количества одних и уменьшении других запускается развитие того или иного заболевания. При коррекции возникшего дисбиоза возможно восстановление нарушенных функций.

    Поражение органа зрения, выражающееся в возникновении диабетической ретинопатии (ДР) и диабетического макулярного отека (ДМО) при сахарном диабете (СД) занимает особое место, так как существенно влияет на качество жизни больных. В развитии ДМО ряд отечественных и зарубежных авторов показывают значимость некоторых цитокинов и факторов роста, имеющих разнонаправленное действие. К ним относятся как провоспалительные и проангиогенные интерлейкины (IL-1, IL- 6, IL-8), фактор некроза опухоли (TNF-α), так и противовоспалительные (IL-4, IL-10), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF, Vascular endothelial growth factor) и антипролиферативный фактор пигментного эпителия (PEGF, Pigment epithelium-derived factor). Дисбаланс указанных факторов как в местном, так и в системном кровотоке приводит к разрыву межклеточных контактов, гибели перицитов капилляров, увеличению сосудистой проницаемости, нарушению функционирования гематоретинального барьера, что влечет за собой развитие отека и вазопролиферацию [5].

    Проведенные исследования микробиома глаза выявили уникальное скопление микробов, отличающееся от других органов организма [6, 7]. Исследования внутриглазных жидкостей, таких как влага передней камеры и стекловидное тело, немногочисленны [8]. Диагностика внутриглазных возбудителей представляет собой непростую задачу, которая еще более осложняется присутствием в основном труднокультивируемых и некультивируемых микроорганизмов. Применение метагеномного секвенирования решает данную задачу. В частности, по результатам исследований с применением секвенирования было отмечено, что стекловидное тело, возможно, нестерильно [9, 10].

    Например, зарубежными учеными был исследована микробиота стекловидного тела при постлихорадочном ретините (ПР) и группой сравнения, куда были включены пациенты со сквозными макулярными разрывами и с регматогенной отслойкой сетчатки. В результате данного исследования выявлено что 14 родов микроорганизмов были общими для обеих групп и включали Anaerotruncus, Acetonema, Bacillus, Bdellovibrio, Geobacillus, Janthinobacterium, Mesorhizobium, Paenibacillus, Pelosinus, Sediminibacterium, Shigella, Sporomusa и Thermosinus. Сетевой анализ также показал, что 2 рода, а именно Arthrobacter и Shimwellia, присутствовали только в группе контроля и отсутствовали в группе пациентов с ПР. В то же время в группе ПР были обнаружены 2 рода бактерий, а именно Pimelobacter и Tannerella, которые отсутствовали в группе контроля [10].

    Учитывая результаты проведенного исследования микробиоты стекловидного тела и роли воспаления в патогенезе ДМО, можно выдвинуть гипотезу, что в развитии патологических изменений сетчатки при СД могут играть роль представители микробиоты стекловидного тела.

    Цель

    Изучить микробиоту стекловидного тела у пациентов с ДМО бактериологическим методом.

    Материал и методы

    В исследование вошло 48 пациентов (49 глаз), проходивших лечение по поводу ДМО в Уфимском НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, которые были разделены на 2 группы. Средний возраст пациентов составил 62,4±4,5 года. Женщин было 25 (52,0%), мужчин – 23 (48,0%). В 1-ю группу исследования были включены 28 пациентов (29 глаз) с ДМО, из них у 20 пациентов (21 глаз) была непролиферативная стадия ДР и у 8 пациентов – пролиферативная; 2-я группа (сравнения) состояла из 20 пациентов (20 глаз) со свежей регматогенной отслойкой сетчатки и сквозными макулярными разрывами.

    У всех пациентов в стерильных условиях операционной после инстилляции анестетика (инокаина), обработки операционного поля раствором бетадина 10% дважды и установки склеральных клапаных портов 25G в 3,5 мм от лимба в проекции плоской части цилиарного тела (без включения инфузии) с помощью витреотома под визуальным контролем осуществлялся забор стекловидного тела в объеме 400 мкл. У пациентов 1-й группы после забора стекловидного тела было выполнено интравитреальное введение анти-VEGF-препарата, пациентам 2-й группы была сделана запланированная витрэктомия.

    Для определения состава микробиоты стекловидного тела применялся классический культуральный метод.

    Для этой цели забранный материал помещался в пробирку с тиогликолевой транспортной средой (Оболенск, Россия), содержащую консервант, препятствующий росту сторонней микрофлоры, и стабилизатор, предохраняющий клетки человека и бактерий от лизиса и разрушения в процессе хранения и транспортировки. Пробирка в течение 1 ч после забора транспортировалась в лабораторию микробиома человека БГМУ. Далее образцы инкубировали в течение 24 ч при температуре 37 °C в термошейкере с целью увеличения биомассы. На 2-е сутки производили посев на питательные среды: кровяной агар, желточно-солевой агар и агар Сабуро с последующей идентификацией на масс-спектрометре (Automs 2600). Также забор производили в стерильные сухие пробирки типа «эппендорф» для последующего выделения ДНК и секвенирования.

    Результаты и обсуждение

    В результате посева образцов стекловидного тела на питательные среды у 2 пациентов 1-й группы выявлен рост бактерий рода Bacillus megaterium и B. pumilus и у 1 пациента был обнаружен рост Escherichia coli и Staphylococcus hominis. У пациентов 2-й группы (контроля) рост колоний бактерий на питательных средах во всех случаях отсутствовал.

    В литературе описывается, что чаще всего у пациентов с СД обнаруживаются в конъюнктивальной полости грамотрицательные бактерии [11, 12]. А результаты метагеномного секвенирования продемонстрировали обилие условно-патогенных бактерий на глазной поверхности пациентов с СД [13, 14]. Показана также более высокая доля бактерий из семейств Enterobacteriaceae, Neisseriaceae, родов Escherichia-Shigella и Pseudomonas в группе СД, особенно при наличии у пациентов ДР [12].

    У пациентов с СД наиболее распространенным агентом конъюнктивальной полости, вызывающим эндофтальмит является коагулазонегативный Staphylococcus epidermidis, также нередко обнаруживается и S. aureus. У пациентов с ДМО часто идентифицируется S. epidermidis (в 38,8% случаев) и Corynebacterium spp. (в 13,8%). Коагулазонегативные стафилококки и грамотрицательные бактерии описаны как наиболее частые возбудители эндофтальмита у пациентов с диабетом [15]. В одном исследовании у пациента с ДР и диффузным макулярным отеком в стекловидном теле был обнаружен S. epidermidis, чувствительный к местному лечению антибиотиком левофлоксацином [16].

    Интересным является факт обнаружения нами бактерий рода Bacillus в нетипичной для них локализации.

    Как известно, Bacillus spp. являются хорошо изученными спорообразующими грамположительными бактериями и существуют как аэробы, так и как факультативные анаэробы [17]. B. megaterium, например, является обычным обитателем почвы и кишечника [18]. Описываются случаи, когда почвенные ризосферные бактерии, например, Agrobacterium radiobacter вызывали эндофтальмит после внутриполостных офтальмологических манипуляций [19, 20].

    Считается, что микробиом кишечника у пациентов с СД может влиять на целостность кишечного барьера, что позволяет бактериям и их метаболитам проникать в общий кровоток. Другими словами, возможно, в глазу и конкретно сетчатке могут находиться бактерии, которые попадают туда из кишечника. А это, в свою очередь, может привести к активации эндотелия сетчатки, развитии воспаления и играть определенную роль в патогенезе ДР.

    В живых биологических системах на мышах был изучен состав микробиома кишечника, плазмы крови и глаз. У мышей с ДР в сетчатке были идентифицированы бактерии родов Corynebacterium, Pseudomonas, Lactobacillus, Staphylococcus, Enterococcus и Bacillus. Также наблюдались более низкие уровни Akkermansia, Corynebacterium, Faecalibacterium и Staphylococcus, чем у мышей контрольной группы [21]. В том же исследовании на мышах была выявлена повышенная численность бактерий рода Bacillus у особей с экспериментальной ДР.

    Данные вид бактерий, как уже указывалось выше, обитают в небольшом количестве в кишечнике и из-за широкого спектра секретируемых ими соединений могут оказывать серьезное влияние на его эпителий и целостность кишечного барьера, особенно это касается людей с пониженным иммунным статусом [22]. Считается, что бактерии рода Bacillus могут также быть одной из основных причин эндогенного эндофтальмита и тяжелой внутриглазной инфекции [21], а диабет является отягощающим фактором, ведущим к развитию офтальмологических осложнений [23]. Большое количество Bacillus spp. в диабетической сетчатке создают внутриглазную воспалительную среду, что может способствовать прогрессированию ДР и развитию ДМО [21].

    Заключение

    Изучение микробиоты глаза у пациентов с СД и его проявлениями в виде ДР и ДМО позволяет оценить наличие определенного состава микроорганизмов во внутриглазных средах, в частности, стекловидном теле. Низкая частота обнаружения (всего у 3 пациентов из 28) бактериальных изолятов в клиническом материале, возможно, связана с особенностями культивирования и необходимостью особых условий роста бактерий из стекловидного тела. Однако определенный спектр выявленных микроорганизмов (в частности, Bacillus spp.) может указывать на нестерильность внутриглазных сред и присутствие определенного состава микробиоты, которая, не исключено, играет определенную патогенетическую роль в развитии макулярного отека.

    Необходимо дальнейшее проведение секвенирования полученных образцов для определения состава микробиома стекловидного тела при изучаемой патологии в сравнении с группой контроля с целью улучшения диагностических, терапевтических и профилактических мер у пациентов с ДР и ДМО.

    Информация об авторах

    Бикбов Мухаррам Мухтарамович, д.м.н., профессор, директор Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, https://orcid.org/0000-0002-9476-8883

    Кудоярова Ксения Игоревна, и.о. заведующей 4 микрохирургического отделения Уф НИИ ГБ ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, pasinkowa2012@yandex.ru,orcid.org/0000-0002-2148-4708

    Гимранова Ирина Анатольевна, к.м.н., доцент, заведующая кафедрой фундаментальной и прикладной микробиологии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, mia8408@mail.ru, https://orcid.org/0000- 0003-3330-9437

    Газизуллина Гульнара Раилевна, заведующая лабораторией микробиома человека ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, akhmetova.29@bk.ru, https://orcid.org/0009-0005-2508-7901

    Хакимова Лилия Ралисовна, к.б.н., доцент кафедры фундаментальной и прикладной микробиологии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, lili-nigmatullina@bk.ru, https://orcid.org/0000-0003-0979-0283

    Валиахметова Диана Земфировна, лаборант лаборатории микробиома человека ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, zdz1999@ mail.ru, https://orcid.org/0009-0005-6666-8497

    Information about the authors

    Mukharram M. Bikbov, MD, Professor, Director of the Ufa Eye Research Institute, https://orcid.org/0000-0002-9476-8883

    Ksenia I. Kudoyarova, Acting Head of the 4th Microsurgical Department of the Ufa Eye Research Institute, https://orcid.org/0000-0002- 2148-4708, pasinkowa2012@yandex.ru

    Irina A. Gimranova, Ph.D., assistant professor, Head. department Fundamental and Applied Microbiology of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education BSMU of the Ministry of Health of Russia, mia8408@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-3330-9437

    Gulnara R. Gazizullina, Head of the Laboratory of Human Microbiome, of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education BSMU of the Ministry of Health of Russia, akhmetova.29@bk.ru, https://orcid.org/0009-0005-2508-7901

    Liliya R. Khakimova, Candidate of Biological Sciences, Associate Professor of the Department of Fundamental and Applied Microbiology of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education BSMU of the Ministry of Health of Russia, lili-nigmatullina@bk.ru, https://orcid.org/0000-0003-0979-0283

    Diana Z. Valiakhmetova, laboratory assistant at the laboratory of human microbiome, of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education BSMU of the Ministry of Health of Russia, zdz1999@mail.ru, https://orcid.org/0009-0005-6666-8497

    Вклад авторов:

    Бикбов М.М. – Существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    Гимранова И.А. – редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации, написание текста.

    Кудоярова К.И. – сбор, анализ и обработка клинического материала, статистическая обработка данных, написание текста.

    Газизуллина Г.Р. – консультирование.

    Хакимова Л.Р. – анализ и обработка материала.

    Валиахметова Д.З. – анализ и обработка материала.

    Author’s contribution

    Bikbov M.M. – Significant contribution to the concept and design of the work, editing, final approval of the version to be published.

    Kudoyarova K.I. – collection, analysis and processing of clinical material, statistical data processing, text writing.

    Gimranova I.A. – editing, final approval of the version to be published, text writing.

    Gazizullina G.R. – consulting.

    Khakimova L.R. – analysis and processing of material.

    Valiakhmetova D.Z. – analysis and processing of material.

    Финансирование: Работа выполнена за счет средств Программы стратегического академического лидерства Башкирского государственного медицинского университета (Приоритет – 2030).

    Funding: This work was supporltd by the Bashkir State medical University Strategic Academic Leadership Program (PRIORITY-2030).

    Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия пациентов на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.

    Patient consent to publication: Written consent from the patients for publication of this material was not obtained. It does not contain any personally identifiable information.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Conflict of Interest: None.

    Поступила: 23.04.2024

    Переработана: 28.06.2024

    Принята к печати: 04.07.2024

    Originally received: 23.04.2024

    Final revision: 28.06.2024

    Accepted: 04.07.2024