Рис. 1. Сравнение качества изображения глазного дна при проведении исследования с помощью смартфона и стандартной фундоскопии. А – Цветная фотография глазного дна, полученная с помощью системы PEEK для смартфона. В – Цветная фотография глазного дна, полученная с помощью стандартной фундус-камеры
Рис. 2. Проведение СЛО с использованием адаптивной оптики. А – Палочковые фоторецепторы центральной зоны фовеа. В – Палочковые и колбочковые фоторецепторы центральной зоны фовеа на расстоянии 10° к височной области. С – Полосы слоя нервных волокон сетчатки. D – Мельчайшие капилляры сетчатки. (Цена деления шкалы – 20 мкм)
Топографическое исследование сетчатки дает возможность получить цветные фотографии. Впервые прижизненные фотографии глазного дна получили доктора Jackman и Webster конце XIX. В 50-е гг. XX века исследования с применением 35-мм фотокамеры и электронной вспышки были включены в список стандартных исследований, необходимых для проведения оптимального лечения пациентов с патологией глазного дна. В последнее время наметилась тенденция к использованию смартфонов для исследования заднего отрезка глаза. На сегодняшний день имеются специальные адаптеры, позволяющие получать фотографии с помощью смартфонов при проведении прямой офтальмоскопии. Одним из недавних достижений стала система PEEK для смартфона, позволяющая провести всестороннее исследование заднего отрезка глаза (рис. 1). Очевидно, что новые технологии дают определенные преимущества для обследования детей и пациентов в развивающихся странах.
В фундус-камерах используется яркий белый свет для освещения глазного дна во время исследования. Он отражается от сетчатки, и изображение глазного дна фиксируется на пленке или в цифровом виде. В 80-х годах XX века в клиническую практику был введен сканирующий лазерный офтальмоскоп (СЛО), обеспечивающий альтернативный метод получения изображения сетчатки. Лазерный луч с определенной длиной волны сканирует сетчатку по параллельным горизонтальным линиям. Благодаря освещению небольшой зоны сетчатки, эффект светорассеяния уменьшается, что обеспечивает получение изображений с более высокой контрастностью по сравнению с фундус-камерами. Во многих СЛО используется конфокальная апертура, что гарантирует отражение света только от исследуемого участка сетчатки и позволяет получать несколько изображений в различных плоскостях для создания трехмерного изображения при реконструкции. По данной методике проводят исследование диска зрительного нерва у пациентов с глаукомой. Алгоритмы программного обеспечения, разработанного специалистами фирмы Heidelberg, были направлены на создание качественного изображения, в настоящее время их используют для получения изображения в режиме реального времени с возможностью слежения за движениями глаза.
Поскольку проникновение света вглубь ткани зависит от длины волны, использование монохроматических световых фильтров позволяет визуализировать анатомические структуры сетчатки. Свет с большей длиной волны проникает глубже, что обеспечивает получение изображения глубоких слоев сетчатки и сосудистой оболочки. Излучение с короткими волнами, например, в синем спектре, позволяет получать изображение поверхностных слоев сетчатки, как, например, слоя нервных волокон и капиллярной сети. При использовании красного фильтра (зеленый свет) возможно получать изображения пигментного эпителия сетчатки (ПЭС). Изображения, полученные с помощью СЛО, являются монохроматическими, поскольку используются источники лазерного излучения с фиксированными длинами волн. В настоящее время фирма Heidelberg Engineering создает аппарат с многоцветным излучением, который позволит получать изображения после прохождения через голубой, зеленый и близкий к инфракрасному фильтры.
Угол поля зрения при получении стандартных изображений глазного дна с помощью фундус-камеры или СЛО составляет от 30 до 50°, что соответствует от 5 до 15% поверхности сетчатки. При этом имеется возможность визуализировать область заднего полюса глаза, но значительная зона периферии сетчатки в объектив не попадает. В последнее время появились широкоугольные бесконтактные системы (Optos p200 system, Optos, Шотландия), позволяющие получать изображения сетчатки в полном объеме. Использование большого зеркала эллипсоидной формы с двумя фокальными длинами, что позволяет расширить углы сканирования до 200° и сканировать сетчатку вплоть до зубчатой линии (Heidelberg Engineering).
Латеральное оптическое разрешение фундус-камер и СЛО ограничено наличием астигматизма и аберраций высшего порядка оптической системы глаза. Вплоть до 90х годов XX столетия не существовало какого-либо эффективного способа скомпенсировать эти дефекты. В настоящее время сенсоры волнового фронта Hartman-Shark, разработанные для использования в астрономии, были адаптированы для применения в офтальмологии. Главным преимуществом этих приспособлений является коррекция аберраций высшего порядка во время проведения лазерных рефракционных операций. Аберрации являются уникальными для каждого глаза. Коррекция аберраций требует от оптических элементов способности принимать различные конфигурации с течением времени. Этого эффекта удалось достичь благодаря использованию деформирующихся зеркал, имеющих большое количество небольших контролируемых с помощью электроники датчиков, которые обеспечивают необходимую конфигурацию (адаптивная оптика), что позволяет получать изображения сетчатки бесконтактным способом с разрешением на уровне молекулярного строения.
Рис. 3. Изображения глазного дна здорового человека и кролика, полученные с помощью спектральной оксигемометрии. (Левая и средняя колонки) Два псевдоцветных изображения, полученные при исследовании глазного дна здорового добровольца и (правая колонка) кролика. Выявлена значительная разница степени насыщения (оксигенации) крови кислородом между артериями и венами человека (левая и средняя колонки) по сравнению с артериями и венами кролика (правая колонка). У кроликов базовая артериовенозная (АВ) линия ниже (10-20%), чем у человека (25-35%), что количественно отражено на оксигемометрической шкале: красный цвет – 100% насыщение (оксигенация), синий цвет – 50% насыщение (оксигенация). На монохроматическом изображении под каждым цветом, обозначающим степень насыщения (оксигенации) крови кислородом, иллюстрируется поглощение стенками сосудов сетчатки лучей света с соответствующими длинами волн. Также отмечено снижение коэффициента поглощения света тканями артерий сетчатки человека по сравнению с венами сетчатки в диапазоне 600 нм. Эта разница очень незначительна у кроликов из-за меньшей разницы базовой АВ линии
Рис. 4. Приспособления для проведения ОКТ во время операции. (Слева) Проведение периоперационной ОКТ возможно благодаря разработанной ручной системе для проведения ОКТ. (В центре) Ручная система для проведения ОКТ интегрирована в операционный микроскоп, ее используют при невозможности проведения ОКТ непосредственно с использованием ручного датчика. (Справа) Интегрированная интраоперационная система для проведения ОКТ исключает необходимость перемещения системы в пределах операционного поля во время хирургического вмешательства
В 1961 г.доктора Novotny и Alvis впервые провели флюоресцентную ангиографию. Они дополнили стандартную фундус-камеру монохроматическими фильтрами и получили несколько изображений глазного дна после внутривенного введения контрастного вещества – флуоресцеина. В 1970х гг. доктора Hochheimer и Flower провели индоцианин зеленую ангиографию.
Проведение стандартного ангиографического исследования сетчатки обеспечивает широкоугольное изображение сетчатки, но разрешение такого исследования ограничено аберрациями глаза. В результате гистологическое исследование показало, что при этом исследовании капиллярная сеть изображена не полностью. Для решения этой проблемы система адаптивной оптики была добавлена к фильтрам, используемым при проведении флюоресцентной ангиографии. В будущем аналогичные системы позволят бесконтактным способом тщательно исследовать микрососуды сетчатки с целью выявления их плотности, диаметра, извилистости и типа разветвления.
После широкого внедрения ангиографии в клиническую практику оказалось, что многие зоны сетчатки обладают свойством аутофлюоресценции (АФ). В начале 1990х годов доктор Delori с соавт. использовали спектрофотометр для определения спектров активизации и излучения АФ над зонами сетчатки небольшой площади. Оказалось, что доминантным источником АФ является липофусцин – побочный продукт, вырабатываемый во внешнем слое фоторецепторов и аккумулируемый в клетках ПЭС. Использование технологии СЛО позволило получать изображения АФ зон сетчатки большой площади. Использование конфокальной апертуры в значительной степени уменьшает АФ, исходящую от источников света, расположенных кпереди от сетчатки. Чаще всего для получения изображения АФ используют HRA-2 Bluepeak АФ систему (Heidelberd Engeeneering), длина волны излучения для активизации составляет 488 нм. Цифровой офтальмоскоп F-10 (Nidek, Inc., Япония) также является системой СЛО с возможностью изучения АФ. К настоящему времени разработаны и другие системы СЛО для изучения АФ глазного дна.
Спектроскопия – метод исследования взаимодействия любых форм вещества и видимого света. Измеряя интенсивность излучения в зависимости от длины волны по средством определения характеристик сигнатур, возможно определить составляющие материала. В биологических системах комбинация спектроскопии и стандартных методик получения изображения, то есть спектрального изображения, позволяет определить распределение спектроскопических данных. В клинической практике принципы спектроскопии частично используются для проведения оксигемометрии – измерения степени насыщения (оксигенации) артериальной крови кислородом. При проведении оксигемометрии сетчатки невозможно измерить ее светопропускаемость.
В современных приборах для получения спектрального изображения обычно используется один из двух подходов: мультиспектральный и гиперспектральный. Для этой цели, как правило, используют фундус-камеры и системы СЛО, хотя были предприняты попытки использования оптической когерентной томографии (ОКТ). Мультиспектральное изображение основано на измерении отраженного света, полученного на дискретных или узких спектральных полосах. Гиперспектральное изображение основано на измерении света, полученного на узких спектральных полосах смежного спектрального диапазона (рис. 3). Этот подход может обеспечить более точное измерение насыщения (оксигенации) крови кислородом, но он требует использования чувствительных детекторов и мощных компьютеров для проведения быстрого и точного анализа полученного изображения.
Спектроскопию также используют для определения плотности естественного хрусталика, макулярного пигмента, меланина и липофусцина. Кроме того, этот метод применяли для анализа структуры пигмента родопсина.
Фотоакустическая офтальмоскопия (ФАОС) позволяет проводить непосредственное измерение поглощения света тканями сетчатки. ФАОС обеспечивает большую точность оксигемометрии сосудов сетчатки. Доктор Jiao с соавт. представили результаты интеграции технологии ОКТ и сканирующей лазерной оптической фотоаккустической микроскопии в исследовании мелких животных. В настоящее время планируется провести прижизненные исследования человека.
ОКТ является методом получения послойного изображения глаза, аналогично методу ультразвуковой биомикроскопии. При выполнении исследования по этой методике анализируется соотношение фаз опорных и отраженных от ткани исследуемой структуры глаза световых волн, в результате чего происходит интерференция с характерными картинами, которые зависят от несовпадения отраженных волн. Поскольку время задержки и амплитуда одной из волн известны, время задержки и интенсивность возвращения световой волны от ткани исследуемой структуры может быть удалена из картины интерференции. Поскольку длина световой волны значительно короче звуковой волны, ОКТ обеспечивает получение изображений с большим разрешением.
Спектральная ОКТ позволяет анализировать картины интерференции с помощью спектрометра. Альтернативным подходом к исследованию картин интерференции является использование поворотного источника лазерного излучения. Такие аппараты для исследования переднего и заднего отрезков выпускаются фирмами Topcon и Tomey GmbH. Поворотные источники излучения интегрируют в системы ОКТ, использующие излучение с длинной волны от 800 до 900 нм. Они обеспечивают качественное изображение сетчатки, но не позволяют визуализировать детали структур, расположенных под слоем ПЭС. При использовании излучения с длиной волны до 1000 нм становится возможной прижизненная визуализация более глубоких структур (сосудистой оболочки, склеры, диска зрительного нерва, слоя жира в орбите под склерой и субарахноидального пространства вокруг зрительного нерва).
Как правило, системы ОКТ являются стационарными аппаратами. В последнее время стали появляться аппараты альтернативной конструкции: переносной (портативный, ручной) датчик соединяется с настольной консолью с помощью кабеля длиной 1,3 м. Это приспособление используют для обследования детей, включая недоношенных, экспериментальных животных, а также во время проведения хирургических операций (рис. 4).
В настоящее время разрабатывается методика оптической когерентной ангиографии (ОКА), которая позволит получить изображение сетчатки и сосудистой оболочки (рис. 5). Интеграция адаптивной оптики с ОКТ и ОКА позволит получить карту сосудистой системы с высоким аксиальным разрешением.
Для измерения кровотока в сетчатке проводят количественную ангиографию с использованием контрастного вещества. В соответствии с этой методикой концентрацию флуоресцеина в крови в определенный момент времени отмечают на графике и в итоге получают кривую, которая позволяет оценить распределение скорости кровотока. Но без измерения диаметра кровеносных сосудов невозможно определить его скорость. К тому же, введение красителя с помощью инъекции является инвазивным методом.
Допплеровский эффект – это изменение частоты волны при отражении ее от движущегося объекта. Поскольку частота зависит от скорости его движения, этот метод возможно использовать для измерения скорости кровотока в глазном яблоке. Использование допплеровского эффекта в системах для проведения ОКТ позволяет рассчитывать скорость кровотока, а, получив данные диаметра кровеносных сосудов, возможно измерить его абсолютные значения.
Системы для проведения ОКТ обычно имеют диапазон изображения, равный 2,0 мм, и позволяют получать отдельные изображения заднего отрезка глаза (сетчатки, сосудистой оболочки, диска зрительного нерва или структур переднего отрезка глаза (угол передней камеры и роговица).
Оснащение ОКТ источником излучения с поворотным элементом (зеркалом) дает возможность значительно увеличить диапазон и охват переднего отрезка глаза, включая естественный хрусталик или все глазное яблоко. Недавно появился источник излучения, который позволяет получить диапазон изображения до 50,0 мм, с его помощью возможно получить прижизненное трехмерное изображение глазного яблока. Новый источник излучения обеспечивает обнаружение патологии роговицы, передней камеры, радужки и хрусталика; определение биометрических параметров глаза; получение объективных данных развития катаракты, толщины хрусталика, положения интраокулярной линзы, наличия помутнения капсулы хрусталика; выявление воспалительных процессов в стекловидном теле и возрастной макулодистрофии; а также патологии сетчатки, сосудистой оболочки, склеры и зрительного нерва (рис.6).
Рис. 5. На изображении, полученном с помощью неинвазивной фазово-контрастной ОКТ, хорошо видны сосуды сетчатки пациента. Это исследование обеспечивает изображение с высоким разрешением
Рис. 6. На фотографии отображена концепция проведения бинокулярной ОКТ
Как правило, при проведении исследований глазного дна в качестве красителей используют флуоресцеин или индоцианин зеленый. В настоящее время проводятся исследования по применению наночастиц. Например, квантовые точки являются нанокристаллами флуоресцеина, состоящими из селенида кадмия, окруженные оболочкой из сульфида цинка. Квантовые точки значительно ярче, чем большинство органических красителей или протеинов, подвергнутых фотообесцвечиванию. Использование контрастных веществ для улучшения изображения, получаемого с помощью ОКТ, мало изучено, поскольку они по существу недостаточно яркие по сравнению с флуоресцеином. По большому счету, золотые наночастицы возможно использовать в качестве контрастного вещества при проведении ОКТ, такие клинические испытания уже проводятся. Во-первых, они обладают свойством локального поверхностного плазменного резонанса. Это дает в результате светорассеяние в 40 раз больше, чем другие идентичные по размеру частицы, которые не являются плазменными. Во-вторых, их можно сделать такими, чтобы светорассеяние достигло максимума в излучении, близком к инфракрасному спектру, которое используется в системах для проведения ОКТ. В-третьих, они могут быть конъюгированы с направленными лигандами. И, наконец, они растворяются в воде и биосовместимы с тканями глаза. Коллоидное золото применяется для лечения пациентов с ревматоидным артритом уже давно.
Лиганды, как правило, основаны на макромолекулах, таких как пептиды, антителах или протеинах и направлены на получение молекулярного изображения ганглиозных клеток сетчатки (ГКС), ПЭС, эндотелиальных клеток и лейкоцитов. Большого успеха исследователи достигли в получении молекулярного изображения ГКС. Изучение было направлено на выяснение роли дисфункции и апоптоза ГКС в развитии глаукоматозной нейропатии зрительного нерва. Использование методики, названной определением апоптозных клеток сетчатки, было продемонстрировано на животных. При таком подходе Аннексин В, помеченный флуоресцеином, вводили посредством внутриглазной или внутривенной инъекции. Он связывался определенным образом с фосфатидилсерином апоптозных ГКС, после чего эти клетки становились видимыми при исследовании с помощью конфокальных СЛО.
Введение в клиническую практику новых методов обследования пациентов позволило значительно снизить частоту необратимой потери зрения вследствие возрастной макулодистрофии. Кроме того, в настоящее время разрабатываются методики лечения с применением стволовых клеток и генной терапии, которые обещают успех в лечении пациентов с наследственными и дегенеративными заболеваниями сетчатки. Разработка новых способов получения изображения сетчатки должна доказать, что улучшение разрешения и комплексного анализа полученных данных обеспечит возможность выработки оптимальной методикиу лечения больных.
P.A. Keane, S.R. Sadda. Retinal imaging in the twenty-first century. State of the art and future directions // Ophthalmology.– 2014.– Vol. 121.– P. 2489-2500.
