
Рис. 1. Матрицы, изготовленные из синтетических материалов: поли-L-лактид-гликолида (85/15) (ПЛГ), поли-L-лактид-капролактона (85/15) (ПЛК), поли(ε -капролактона) (ПКЛ) (Институт цитологии РАН)

Рис. 2. Подшивание синтетических матриц к глазной поверхности с целью исследования сроков их биодеградации (а, б)
На базах Института цитологии РАН (Санкт-Петербург), Санкт-Петербургского государственного университета промышленных технологий и дизайна (Санкт-Петербург) и Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого (Санкт-Петербург) были проведены исследования по оценке механических и оптических свойств, биосовместимости синтетических полимерных матриц в условиях in vitro с использованием клеточных тест-систем. Результаты исследования показали, что на поверхности матриц возможно поддержание клеточных культур в условиях in vitro. Материалы данной работы в настоящий момент готовятся к публикации.
Цель
Сравнительное исследование сроков биодеградации на глазных поверхностях лабораторных животных синтетических полиэфирных матриц из поли(лактид-гликолида) (ПЛГ), поли(лактид-капролактона) (ПЛК).
Материал и методы
Для приготовления матриц использовали поли-L-лактид-гликолид (85/15) (ПЛГ) (h=3,13 дл/г, Purac), поли-L-лактид-капролактон (85/15) (ПЛК) (h=1,66 дл/г, Purac) и поли(ε -капролактон) (ПКЛ) (Mn 80000, Sigma). Материалы ПЛГ и ПЛК имели степень чистоты Medical Grade. Все полимеры растворяли в трихлорметане (Реактив, Россия) до конечной концентрации в 2 мг/мл и наносили их на предметные стёкла. После испарения растворителя на воздухе, изготовленные матрицы сушили при температуре 37° С до полного удаления растворителя (рис. 1). Толщина образцов каждой из исследуемых синтетических матриц составляла 5, 10 и 15 мкм.
Исследование сроков биодеградации (в днях) матриц из синтетических полимеров выполняли на 12-и кроликах (36 глаз). В зависимости от исследуемого материала были сформированы 3 группы: с использованием матриц из ПЛГ (группа I), матриц из ПЛК (группа II) и матриц из ПКЛ (группа III). В зависимости от толщины материала каждую группу разделили на 3 подгруппы: 5 мкм – подгруппа «А», 10 мкм – «Б», 15 мкм – «В».
Изготовленные в условиях Института цитологии РАН стерильные образцы матриц круглой формы диаметром 20 мм в условиях учебной операционной клиники офтальмологии ВМедА под микроскопом укладывали на поверхность роговицы с захватом на 1-2 мм перилимбальной конъюнктивы, к которой фиксировали матрицу по краям 8 узловыми швами нейлоновой нитью 10/0 фирмы Alcon (США) (рис. 2а, б).
В послеоперационном периоде проводили консервативное лечение в объеме: инстилляции декса-гентамицина 3 раза в день (до 21 сут.). Сроки наблюдения составили – 3, 10, 21, 30 сут. Выполнялась биомикроскопия глаз в каждой группе исследования на щелевой лампе Haag-Streit BD900 (Швейцария) с фотографированием. Оценивался процесс биодеградации матриц в динамике (истончение матриц в области наложения швов, появление участков деструкции) и сроки их полной деградации. Под полной биодеградацией подразумевали отсутствие матриц на глазной поверхности либо наличие остатков матриц в местах наложения швов с их отсутствием на поверхности роговицы.
Результаты
В результате наблюдения процессов биодеградации в I группе на 3-и сутки ни в одном случае признаков деградации материала выявлено не было. Отмечали равномерное покрытие глазной поверхности во всех подгруппах. На 10-е сутки наблюдения отмечали истончение краев матриц в области наложения швов только в подгруппе «А». Признаков деградации матриц в подгруппах «Б» и «В» не было. На 21-е сутки на матрицах в подгруппе «А» наблюдали появление отдельных участков деструкции материала. В подгруппе «Б» имелись дефекты материала в области швов. В подгруппе «В» изменений целостности материала не было. На 30-е сутки в 66% случаев отмечали полную деградацию матриц в подгруппе «А» (рис. 3а). На матрицах в подгруппе «Б» наблюдали появление отдельных единичных участков деградации матриц. Матрицы в подгруппе «В» претерпевали лишь начальные изменения целостности в области наложения швов.
В результате наблюдения биодеградации матриц во II группе на 3-и сутки отмечали появление первых признаков деградации лишь образцов в подгруппе «А». Признаков деградации матриц в подгруппах «Б» и «В» не было. На 10-е сутки на матрицах в подгруппе «А» отмечали появление участков краевой деструкции на образцах в подгруппе «Б» наблюдали начальные признаки деградации материала в области швов. Признаков деградации матриц в подгруппе «В» не было. На 21-е сутки наблюдалась выраженная деструкция матриц в подгруппе «А». На матрицах в подгруппе «Б» отмечали появление областей деструкции и постепенного «подворачивания» по периферии. На образцах в подгруппе «В» имелись признаки начальной деградации в области наложения швов. На 30-е сутки в подгруппе «А» в 100% случаев матрицы полностью деградировали (рис. 3б). Образцы матриц в подгруппе «Б» продолжали деградировать с «подворачиванием» их краев по периферии. Образцы в подгруппе «В» имели изменения в виде островковых областей деструкции.
В результате наблюдения процессов биодеградации в III группе на 3-и, 10-е и 21-е сутки ни в одном случае признаков деградации материала выявлено не было. Отмечали равномерное покрытие глазной поверхности во всех подгруппах. На 30-е сутки наблюдения отмечали истончение краев матриц в области наложения швов только в подгруппе «А» (рис. 3в). Признаков деградации матриц в подгруппах «Б» и «В» не было.
Обсуждение
При сравнении сроков биодеградации было выявлено, что матрицы из ПЛК (5 мкм) начинали заметно деградировать уже на 10-е сутки, тогда как на образцах матриц из ПЛГ (5 мкм) достоверные признаки деградации наблюдались значительно позже (21-е сутки). Первые признаки деградации матриц из ПКЛ наблюдались лишь на 30 сутки лишь в подгруппе с толщиной образцов 5 мкм. Полная биодеградация матриц из ПЛК с толщиной 5 мкм занимала не более 30 суток. Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что скорость биодеградации матриц из ПЛК толщиной 5 мкм протекала быстрее, чем из ПЛГ этой же толщины, и по своим срокам сопоставима со сроками лизирования амниотической мембраны на поверхности роговицы [2]. Таким образом, наиболее благоприятное для трансплантации стволовых клеток роговицы сочетание изучаемых свойств оказалось у матриц из ПЛК.
Выводы
1. В зависимости от результатов исследования сроков биодеградации определена наиболее подходящая модель носителя для культивирования и трансплантации стволовых клеток роговицы – матрица из поли(лактид-капролактона) (85/15) толщиной 5 мкм.
2. Полученные результаты исследования сроков биодеградации свидетельствуют о необходимости дальнейшего экспериментального исследования синтетических матриц как носителей для культивированных лимбальных стволовых клеток с целью устранения лимбальной недостаточности.