Исследование цитотоксического воздействия квантовых точек на клеточных культурах роговицы и конъюнктивы человека в аспекте перспектив лечения инфекционного кератита

   Актуальность

   Кератит является одним из наиболее распространенных заболеваний глаз, проявляющихся частичной или полной потерей зрительных функций. По данным Всемирной организации здравоохранения, инфекционные кератиты стоят на 5-м месте в структуре причин слепоты и слабовидения в мире [1].

   Клинически кератит проявляется воспалением роговой оболочки в результате воздействия экзогенных либо эндогенных факторов. К экзогенным факторам относятся: травма глаза, оперативное вмешательство, ношение контактных линз, местное длительное применение кортикостероидов, химическое воздействие, ультрафиолетовое облучение, хронические воспалительные заболевания роговицы и др. С эндогенными факторами связывают заболевания полости рта и околоносовых пазух, наследственную предрасположенность, сахарный диабет и другие соматические расстройства [2]. Возбудителями инфекционных кератитов, как правило, являются бактерии, грибы, вирусы, простейшие и крайне редко паразиты. Бактериальные кератиты чаще обусловлены такими патогенами, как Staphylococcus spp. (золотистый стафилококк), коагулазонегативные стафилококки (CоNS), Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa [3].

   Среди грибов поражения зрительного анализатора вызывают представители 3 классов: дрожжи, плесневые грибы (нитевидные) и диморфные грибы. Наиболее широко распространены при кератите дрожжевые кератомикозы (Candida spp. и Cryptococcus spp.). Из плесневых грибковых микроорганизмов поражение глаз чаще вызывают Fusarium spp., Aspergillus spp., намного реже Curvularia spp., Cephalosporium spp., Paecilomyces spp., некоторые виды Penicillium spp., Mucor spp. Среди дифазных грибов (редкие случаи в офтальмологии) встречаются Histoplasma spp., Blastomyces spp., Coccidioides spp. [4–9].

   Крайне редко кератиты вызывают микроспоридии – одноклеточные микроорганизмы из типа Microspora царства Protista. Инфекционной формой микроспоридий являются внутриклеточные споры. Впервые микроспоридии были выделены из фекалий больных кишечным микроспоридозом, из воды и пищевых продуктов [10, 11].

   Среди вирусной этиологии кератитов преобладают герпесвирусы: вирус простого герпеса 1-го типа (HSV-1), вирус ветряной оспы (VZV), цитомегаловирус (CMV). Реже кератит вызывает вирус краснухи (Rubella virus) [12].

   Среди простейших основным возбудителем кератитов являются акантамебы. Acantamoeba spp. широко распространены в природе, обитают в почве, пресных и соленых водоемах. Поражение роговицы чаще вызывают Ac. castellani, Ac. culbertsoni, Ac. polyphaga, Ac. rhysodes, Ac. hatchetti [13]. Как правило, такие поражения ассоциированы с бытовыми микротравмами роговицы или опосредованы ношением мягких контактных линз.

   Ранняя диагностика инфекционных кератитов и назначение этиотропной терапии являются ключевыми моментами профилактики развития осложнений. В консервативном лечении необходимо разумное применение противомикробных и противовоспалительных препаратов, целью которых является минимизация риска селекции антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов и профилактика локальной иммуносупрессии.

   Несомненно, в практической деятельности офтальмолога, занимающегося консервативным лечением воспалительных заболеваний переднего сегмента глаза, ключевой группой антиинфекционных препаратов, применяемых в рутинной практике, являются антибиотики и антимикотики.

   Ряд крупных эпидемиологических исследований, посвященных проблемам антибиотикорезистентности, широко представлен в доступной литературе. Например, в отчете исследования ARMOUR, проведенного в США с 2009 по 2018 г. (исследовано 2599 изолятов S. aureus и 2143 изолята CoNS, выделенных при глазных инфекциях), сообщалось, что 34,9% штаммов S. aureus были устойчивы к метициллину (MRSA). Резистентность к ципрофлоксацину наблюдалась у 32,2% штаммов S. aureus, среди которых 10,4% были чувствительны к метициллину, а 72,7% штаммов – устойчивы к метициллину (MRSA).

   Среди CоNS 32,2% штаммов были резистентными к ципрофлоксацину [14]. В подобных эпидемиологических исследованиях в Австралии в период с 2012 по 2016 г. были исследованы 884 изолята возбудителей кератита. В работе сообщается о более низких показателях резистентности к ципрофлоксацину: 16% среди штаммов S. aureus и 8% у штаммов CoNS. Устойчивость к метициллину выявлена у 7% штаммов S. aureus (MRSA) и у 19% штаммов CoNS [15]. Проблема устойчивости к противогрибковым препаратам также достаточно высока среди ряда грибов [16, 17].

   В России по результатам исследований чувствительности к антибиотикам возбудителей заболеваний глаз были получены следующие результаты. В многоцентровом исследовании В.К. Самуйло проанализировано 235 штаммов и показана низкая частота MRSA – 4,2%.

   Штаммы S. aureus наиболее часто были резистентны в отношении тетрациклина – 18%. В целом Staphylococcus spp. показали резистентность к оксациллину у 48% штаммов, эритромицину – у 33%, хлорамфениколу – у 40%, ципрофлоксацину – у 29% штаммов. Относительно Pseudomonas spp. установлена резистентность к гентамицину у 20% штаммов [18].

   По результатам наблюдений Санкт-Петербургского филиала ФГАУ «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова в период с 1991 по 2015 г. было показано постепенное увеличение доли антибиотикорезистенных штаммов возбудителей инфекций глаза. В итоге обнаружена антибиотикорезистентность штаммов CoNS к эритромицину в 57,4%, в 31–33% резистентность к хлорфениколу, тобрамицину, ципрофлоксацину, офлоксацину. Стрептококки демонстрируют высокую резистентность к эритромицину (50%), к тобрамицину (63%), к ципрофлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину (33%).

   Синегнойная палочка показала высокую резистентность к эритромицину (95%), к хлорфениколу и тетрациклину (57–58%), к тобрамицину (48%), ципрофлоксацину (39%) [19].

   В лечении вирусных кератитов широко применяют нуклеозиды (например, ацикловир и его аналоги для лечения герпесвирусов), к которым также развивается лекарственная устойчивость, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом [12]. Глюкокортикоиды, использующиеся в комплексной терапии бактериальных и вирусных кератитов для снижения воспалительного и болевого синдрома, способны вызывать локальную иммуносупрессию, что является аргументом к формированию противопоказаний к их назначению при грибковой этиологии процесса [20].

   В этой связи существует мировая проблема преодоления кризиса резистентности к антиинфекционным препаратам, что требует поиска новых эффективных и доступных методов лечения инфекционных заболеваний, в том числе и глазных инфекций.

   Новой альтернативной технологией лечения инфекций глаза в будущем может послужить коллоидный раствор наночастиц – квантовых точек (КТ). За счет многонаправленного физико-химического воздействия на возбудителей инфекционных заболеваний КТ могут стать универсальным средством для лечения бактериальной, грибковой и, возможно, вирусной инфекции глазного яблока.

   КТ полупроводникового типа, рассматриваемые в данном исследовании, представляют собой кристаллы нанометрового размера (в медицине актуальны КТ размером 2–10 нм) с моделируемыми оптическими и электронными свойствами за счет изменения объема и состава их ядра и поверхностных оболочек [21]. Диаметр ядра, число оболочек на поверхности КТ, характер покрытия на границе раздела ядро – оболочка (пассивация), специфического покрытия для связывания с биологически активными молекулами (функционализация) также позволяют использовать их в различных областях науки, техники и медицины [22].

   Перспективность применения полупроводниковых КТ в качестве антиинфекционных агентов в чистом виде и в составе коньюгатов с антибиотиками убедительно описана в работах [23–25]. Потенциал минимизации селекции штаммов с антибиотикорезистентностью реализуется за счет двойного механизма действия применяемых соединений, один из которых реализуется за счет физического взаимодействия КТ с бактериальной клеткой, разрушении ее клеточной мембраны [26] в сочетании с моделируемой выработкой супероксидных радикалов [27], второй опосредован собственным механизмом действия антибиотика.

   Однако, если перспективность КТ и коньюгатов на их основе уже не вызывает сомнений, то вопросы, определяющие безопасность их потенциального использования, выходят на первый план, что и определяет цель настоящего исследования.

   Использование клеточных линий для изучения цитотоксичности в последние годы получило широкое распространение во многих областях медицинской деятельности [28]. Применение коллекционных паспортизированных линий клеток с известными свойствами обеспечивает воспроизводимость результатов опытов по изучению характера биологической активности тестируемых соединений непосредственно на клеточном уровне, позволяет оценивать состояние клеток-мишеней прижизненно, а не post faсtum [29, 30].

   Цель

   Исследовать цитотоксическое воздействие КТ на культурах клеток роговицы и конъюнктивы человека для определения их безопасной концентрации в лечении инфекционных кератитов.

   Материал и методы

   Исследование проводилось на клеточных культурах HCEC и Clone 1-5c-4, которые подвергали воздействию одно- и двухоболочечных полупроводниковых наночастиц – КТ 3 типов:

   1) КТ1 – CdTe/Cd (теллурид кадмиевые) MPA 710;

   2) КТ2 – Ag (10%) InP/ZnS (фосфид индиевые, допированные серебром) MPA 710;

   3) КТ3 – InP/ZnSe/ZnS (фосфид индиевые) 650 MPA.

   Клеточные культуры. Для эксперимента использовали клеточные культуры Clone 1-5c-4 (человек, нормальная конъюнктива) и HCEC (человек, эпителиальные клетки роговицы) из коллекции культур клеток ФБУН ФНИИВИ «Виром» Роспотребнадзора. Восстановление культур клеток после криоконсервации проводили по стандартной методике [31].

   Квантовые точки. КТ синтезировали во ФГУП НИИ «Прикладная акустика» (г. Дубна, Московская область) в соответствии с техническим заданием, которое учитывало спектральные и физико-химические характеристики КТ, подходящие для офтальмологического применения, и способность КТ к управляемой генерации супероксидных радикалов, присутствуя в среде живого организма. В ходе нисходящего синтеза был генерирован водный коллоидный 10% масс. раствор КТ1, КТ2, КТ3.

   Далее на базе университетского научно-образовательного центра «Наноматериалы и нанотехнологии» (НОЦ «Нанотех») УрФУ (г. Екатеринбург) выполнялась паспортизация КТ1, КТ2, КТ3 с оценкой физико-химических характеристик, регистрацией спектров флуоресценции и оптического поглощения на предмет соответствия поставленному техническому заданию.

   Физико-химическая характеристика КТ:

   1. Размерный ряд КТ варьирует в пределах от 5 до 10 нм (в среднем 7,5±0,23 нм), что определяет способность КТ проникать через межклеточные каналы и мембрану возбудителя инфекции при взаимодействии c патогенной флорой [32].

   3. Широкий спектр поглощения световых волн (от 350 до 750 нм) с возможностью их активации источником возбуждения видимой области спектра для генерации активных форм кислорода (АФК).

   4. Узкий спектр флуоресценции (свечения) в диапазоне (от 550 до 650 нм), позволяющий минимизировать токсические повреждение тканей глаза, нейроретинальных структур при активации КТ.

   5. Диспергируемость в воде, минимизирующая физические взаимодействия после введения в ткани глаза. Водный раствор обеспечивает возможность эпибульбарного и интравитреального использования.

   6. Квантовый выход флуоресценции как отношение количества испускаемых и поглощаемых фотонов не превышает 0,5 (50%) и является индикатором образования АФК.

   7. Свойства поверхности: 3-меркаптопропионовая кислота –бифункциональная молекула, содержащая карбоксильную и тиольную группу.

   8. Функционализация КТ обеспечивается карбоксильными (-СООН) и аминогуппами (-NH2) для увеличения реакционной способности КТ.

   Культивирование клеточных культур. Клетки Clone 1-5c-4 выращивали в смеси равных объемов сред Eagle МЕМ (HiMedia, Индия) и Medium 199 (HiMedia, Индия); клетки HCEC культивировали с использованием среды F-12 (HiMedia, Индия) с добавлением 10% сыворотки Fetal Bovine Serum (HiMedia, Индия) в культуральных флаконах с площадью 25 см2 (Corning, США) при температуре +37 °С в условиях СО2-инкубатора (Binder, Германия).

   В 1-е сутки оценивали степень прикрепления клеток под инвертированным микроскопом Primovert (Carl Zeiss AG, Германия). На 3-и сутки оценивали плотность и морфологию монослоя согласно паспорту культур (рис. 1, 2).

   Субкультивирование осуществляли по мере формирования монослоя с коэффициентом рассева 1:4 для клеток Clone 1-5c-4 и 1:3 для клеток HCEC. Для снятия клеток использовали диспергирующий раствор – смеси 0,25% раствора трипсина («ПанЭко», Россия) и 0,02% раствора Версена («ПанЭко», Россия). Для наращивания клеточной массы проводили 3 пассажа. Перед проведением опыта проводили контроль контаминации культур микроорганизмами. Для временной оценки токсического воздействия КТ в различных концентрациях клетки засевали в 96-луночные культуральные планшеты (SPL Life Sciences, Корея) из расчета посадочной дозы 2×103 кл/ лунку [33].

   Изучение цитотоксичности квантовых точек. Для эксперимента готовили серию десятикратных разведений КТ1, КТ2, КТ3 на среде MEM (от 10–1 до 10–8). После стандартной процедуры промывки культуры клеток от ростовой среды, в 96-луночный планшет внесли различные разведения квантовых точек. Каждое разведение препарата исследовали в 3 повторностях. В качестве контроля использовали питательную среду без внесения КТ. Планшет с внесенными соединениями помещали в СО2-инкубатор на 72 ч, после чего визуально оценивали наличие цитотоксического действия КТ в зависимости от концентрации. Наблюдение цитотоксического эффекта предполагает визуальное определение при малом увеличении микроскопа и оценку действия тестируемых препаратов на морфологию и жизнеспособность клеток [34, 35].

   Результаты

   В результате проведенного эксперимента установлено, что дозозависимым токсическим эффектом обладают все 3 типа исследуемых КТ в концентрациях от 0,1–0,01 мг/ мл, что проявляется в виде апоптоза клеток культуры тканей. Постепенный апоптоз в культуре конъюнктивы и роговицы проявляется уменьшением ядра и/или цитоплазмы; клетки округляются, теряют веретеновидную форму цитоплазмы; часть клеток теряет цитоплазму, остаются голые ядра деформированной формы; часть клеток полностью разрушаются; нарушается структура монослоя клеток, полуразрушенные клетки образуют скопления (рис. 3 а, б).

   В свою очередь концентрации от 0,001 мкг/мл и меньше на протяжении всего опыта (72 ч) не вызывали структурных изменений в клетках. Клетки в культуре сохраняют структуру монослоя, плотность расположения клеток не меняется, они распределены равномерно, сохраняя форму и размер (рис. 4 а, б).

   В результате исследования установлено, что тестируемые препараты КТ1, КТ2 и КТ3 обладают дозозависимым цитотоксическим эффектом, а именно, нетоксичны в концентрации 0,001, 0,0001, 0,00001 мкг/мл для клеточных культур роговицы (HCEC) и конъюнктивы (Clone 1-5c-4) (рис. 4 а, б), и вызывают токсическое действие в концентрациях 0,1–0,01 мг/мл (рис. 3 а, б).

   Таким образом, определены условно нетоксичные для поверхностных структур глаза диапазоны разведений КТ, которые в последующем могут быть использованы в экспериментах по изучению антиинфекционной активности КТ.

   Обсуждение

   В ходе проведенного эксперимента на культурах клеток конъюнктивы и роговицы человека установлены нетоксичные концентрации КТ от 0,001 мкг/мл и меньше на уровне изучения морфологии и жизнеспособности клеток in vitro. Следует отметить, что в дальнейших экспериментах in vivo мы наблюдали, что для структур переднего и заднего отрезка глаза кроликов нетоксичными были на один порядок более высокие концентрации растворов КТ, а именно от 0,01 мкг/мл и меньше, что было установлено на основании функциональных и клинических методов обследования подопытных животных [22, 36]. Оба этих исследования, на культурах клеток человека и на структурах глаз кроликов, увеличивают прогностическую значимость экстраполяции безопасности препаратов КТ для применения в офтальмологии на людях в будущем. Полученные нами in vitro результаты по биобезопасности КТ для структур глаза человека согласуются с данными других авторов по применению подобных наноструктур в офтальмологии [37–40].

   Более высокую устойчивость структур глаза кроликов к растворам КТ в сравнении с культурами клеток человека можно объяснить тем, что целостный организм на уровне тканевой организации и местной нейроэндокринной регуляции и иммунной защиты является менее уязвимым к воздействию внешних факторов, в нашем случае физико-химического воздействия КТ, чем изолированные популяции клеток in vitro.

   Заключение

   Проведенные исследования цитотоксичности подтвердили биосовместимость растворов КТ в определенных концентрациях с клетками роговицы и конъюнктивы глаза человека. Изучение токсичности и безопасности новых биологически активных молекул является одним из необходимых этапов их доклинического изучения. Применение клеточных культур при оценке безопасности КТ позволяет уменьшить число экспериментов на животных при разработке новых эффективных препаратов на основе КТ. Результаты определения безопасных концентраций КТ на культурах клеток человека прогностически достаточно надежны для экстраполяции на организм.

   Дальнейшие исследования наносистем на основе КТ в качестве внутриклеточного проводника, активатора или непосредственного антиинфекционного препарата обеспечивают многообещающую перспективу разработки синергической терапевтической стратегии лечения инфекционного кератита с применением традиционных препаратов в комбинации с препаратами на основе квантовых точек с благоприятным прогнозом и перспективой клинического применения.

   Информация об авторах

   Вячеслав Олегович Пономарев, к.м.н., врач-офтальмохирург, заместитель генерального директора по научно-клинической работе АО «Екатеринбургский центр МНТК «Микрохирургия глаза», ponomarevmntk@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-2353-9610

   Надежда Сергеевна Демченко, к.м.н., врач клинической лабораторной диагностики и лабораторной генетики АО «Екатеринбургский центр МНТК «Микрохирургия глаза», medichkan@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-5196-2168

   Константин Андреевич Ткаченко, врач-офтальмолог, kostyatka1996@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-8593-9364

   Ольга Семеновна Федотова, к.б.н., ведущий научный сотрудник, и.о. заведующего лабораторией клеточных культур ФБУН ФНИИВИ «Виром» Роспотребнадзора, fedotova_os@niivirom.ru, https://orcid.org/0000-0003-1928-8211

   Information about the authors

   Vyacheslav O. Ponomarev, PhD in Medicine, Ophthalmic surgeon, Deputy general director for scientific and clinical work, ponomarev-mntk@mail. ru, https://orcid.org/0000-0002-2353-9610

   Nadezhda S. Demchenko, PhD in Medicine, Doctor of clinical laboratory diagnostics and laboratory genetics, medichkan@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-5196-2168

   Konstantin A. Tkachenko, Ophthalmologist, kostyatka1996@gmail. com, https://orcid.org/0000-0001-8593-9364

   Ol’ga S. Fedotova, PhD in Biology, Leading Researcher, Acting Head of the Laboratory of Cell Cultures, fedotova_os@niivirom.ru, https://orcid.org/0000-0003-1928-8211

   Вклад авторов в работу:

   В.О. Пономарев: сбор, анализ и обработка материала, написание текста, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

   Н.С. Демченко: написание текста, редактирование.

   К.А. Ткаченко: редактирование.

   О.С. Федотова: написание текста, редактирование.

   Authors’ contribution:

   V.O. Ponomarev: collection, analysis and processing of the material, writing, editing, final approval of the version to be published.

   N.S. Demchenko: writing, editing.

   K.A. Tkachenko: editing.

   O.S. Fedotova: writing, editing.

   Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторе.

   Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.

   Конфликт интересов: Отсутствует.

   Funding: The authors have not declared a specific grant for this research from any funding agency in the public, commercial, or non-profit sector.

   Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.

   Conflict of interest: There is no conflict of interest.

   Поступила: 14.04.2024

   Переработана: 10.07.2024

   Принята к печати: 21.08.2024

   Originally received: 14.04.2024

   Final revision: 10.07.2024

   Accepted: 21.08.2024