Рис. 1. Трансплантация нативной АМ на глазную поверхность
Рис. 2. Изменения в роговице и эпителизация на 7-й, 10-й, 15-й и 20-й день после операции. Пояснения в тексте
Клинически ЛН характеризуются развитием хронического воспаления глазной поверхности, персистирующих и рецидивирующих эрозий роговицы, нарастанием на роговицу конъюнктивального эпителия (конъюнктивализация), врастанием в строму глубоких и поверхностных сосудов с формированием фибровасклярного паннуса (сосудистого бельма) [4].
Зрительная реабилитация пациентов с помутнениями роговицы достигается в основном с помощью операции оптической кератопластики. Обязательным условием для выполнения такой операции на глазах с ЛН является предварительное восстановление нормального эпителиального покрова роговицы. Это возможно посредством операции трансплантации ЛЭСК со второго здорового глаза пациента (лимбальной трансплантации – ЛТ) [1, 5]. Однако при этом глаз-донор лишается достаточно большого сектора лимба, что нежелательно из-за возможности спровоцировать на нем ятрогенную ЛН.
В литературе имеются сообщения об успешном восстановлении роговичного эпителия на глазах с ЛН посредством имплантации ЛЭСК, полученных методом культивирования. Процедура включает выделение и выращивание in vitro аутологичных или аллогенных ЛЭСК из лимбального биоптата площадью от 1 до 2 мм² [8, 9]. В настоящее время разработаны различные способы культивирования, и установлено, что наиболее оптимальным субстратом для размножения и сохранения ЛЭСК в культуре является амниотическая мембрана (АМ) человека [9, 10]. Подобная технология устранения лимбальной недостаточности в последние годы находит все большее распространение в мире. Несмотря на очевидную Актуальность этой проблемы, в нашей стране вопросам культивирования стволовых эпителиальных клеток посвящены единичные сообщения.
Цель
Исследовать возможность применения аутологичных культивированных лимбальных эпителиальных стволовых клеток на амниотической мембране для лечения лимбальной недостаточности в эксперименте.
Материал и методы
Исследование выполнено на 20 половозрелых кроликах породы Шиншилла (40 глаз) весом 2,5-3,5 кг. На всех глазах имел место тотальный фиброваскулярный паннус, образовавшийся через 30 дней после предварительно выполненной нами механической модели ЛН. Животные были разделены на две группы наблюдений: основная (10 кроликов, 20 глаз) с использованием для лечения ЛН нативной амниотической мембраны с культивированным на ее поверхности слоем ЛЭСК (выделенных из фрагментов аутологичной ткани роговичной части лимба ферментативным способом по методу Sefal et al. [11] и культивированных на АМ в нашей модификации [3]), и контрольная – (10 кроликов, 20 глаз) с использованием для лечения ЛН только нативной АМ.
Всем животным выполняли поверхностную кератэктомию. Операцию проводили под наркозом с предоперационной фиксацией кроликов. Дополнительно ретробульбарно вводили 0,3 мл. 2,0% раствора лидокаина и в глаз закапывали 0,4% раствор инокаина. Удаление фиброваскулярного паннуса роговицы осуществляли с захватом на 2-3 мм перилимбальной конъюнктивы. Обнаженную строму роговицы орошали раствором «Бетадина». На подготовленную таким образом для трансплантации глазную поверхность в основной группе укладывали АМ, содержащую на внутренней (обращенной к строме роговицы) стороне культивированные ЛЭСК, а в контрольной – одну только АМ (рис. 1).
АМ распределяли по поверхности роговицы, захватывая зону лимба и на 2-3 мм обнаженную перилимбальную склеру, с последующей фиксацией по краям узловыми швами 8-0 к эписклере. После этого выполняли простую блефарорафию сроком на 7 дней. В послеоперационном периоде всем животным выполняли инстиляции «Вигамокса» («Alcon», США) в течение 14 дней. Наблюдение за клиническим течением заживления и состоянием роговицы осуществляли на 7-й, 10-й, 15-й, 20-й, 30-й, 60-й и 90-й дни после операции.
Интенсивность помутнения роговицы оценивали по 10-балльной шкале Войно-Ясенецкого В.В. [2], степень васкуляризации роговицы – по 4-балльной шкале Inatomi T. [7]. Биомикроскопию выполняли на щелевой лампе «Carl Zeiss» (Германия) при увеличении 10× и 16×, для оценки деэпителизации окрашивали роговицу 1,0% раствором флюоресцеина натрия.
Статистическую обработку результатов исследования проводили в программе «Statistica-10.0», определяли среднее значение и стандартное отклонение. Для сравнения данных, распределенных по закону отличного от нормального, применяли непараметрический критерий (U-критерий Манна – Уитни). Различия между группами считались значимыми при р<0,05.
Результаты
На 7-й и 10-й дни после операции в основной группе животных АМ полностью покрывала роговицу без признаков лизиса. В параоптической и оптической зоне прозрачность роговицы была незначительно снижена за счет легкого помутнения покрывающей АМ – степень помутнения роговицы в среднем составила 2,1 балла. Отмечали нарастание конъюнктивального эпителия на АМ на 1-2 мм. Роста новообразованных сосудов практически не наблюдали. Степень васкуляризации стромы составила 1,2 балла за счет остаточных сосудов (рис. 2а). В контрольной группе АМ также равномерно покрывала роговицу, степень помутнения роговицы – 2,85 балла. Отмечали нарастание на АМ эпителия со стороны лимба на 3-4 мм. За счет начала нарастания со стороны конъюнктивы на АМ новообразованных сосудов степень васкуляризации роговицы составила 1,8 балла (рис. 2б).
На 15-й день в основной группе отмечали начало васкуляризации роговицы на 1-2 мм (1,5 балла). Прозрачность роговицы незначительно снизилась за счет легкого отека АМ (2,0 балла) (рис. 2в). В контрольной группе отмечали помутнение роговицы до 3,55 баллов также за счет набухания АМ, а также врастание сосудов со стороны лимба на 3-4 мм (2,1 балла) (рис. 2г).
На 20-й день в основной группе АМ покрывала роговицу полностью, периферическая васкуляризация составила 1,65 баллов, помутнение – 1,7 балла (рис. 2д). В контрольной группе васкуляризация роговицы носила более активный характер (2,25 балла) с помутнением роговицы до 4,5 балла (рис. 2е).
На 30-й день в основной группе АМ покрывала роговицу полностью; неоваскуляризация (1,2 балла) и помутнение роговицы (1,4 балла) незначительно уменьшились (рис. 3а). Отмечали нарастание на АМ конъюнктивального эпителия с распространением на 2-3 мм на периферию роговицы (рис. 3б). В контрольной группе васкуляризация роговицы увеличилась до 2,95 баллов, прозрачность продолжала снижаться (5,7 баллов) (рис. 3в). Амниотический покров роговицы был полностью эпителизирован. Наблюдали шероховатость, умеренную отечность и неравномерное окрашивание флюоресцеином наросшего эпителия (рис. 3г).
На 60-й день в основной группе отмечали полную деструкцию АМ и самопроизвольное отделение от поверхности роговицы. Строма роговицы под АМ оказалась полностью эпителизированной (рис. 3е), практически прозрачной, без врастания новообразованных сосудов. Степень васкуляризации составила 0,65 балла, степень помутнения роговицы – 1,35 балла (рис. 3д). В контрольной АМ полностью покрывал роговицу и был эпителизирован. При этом эпителий оставался утолщенным, слегка отечным, поверхность его неравномерной, с остаточным островковым окрашиванием флюоресцеином (рис. 3з). Отмечали заметное нарастание помутнения стромы (до 7,2 баллов) с формированием умеренно васкуляризированного бельма. Степень васкуляризации снизилась до 2,3 баллов (рис. 3ж).
На 90-й день на всех глазах основной группы роговица была практически прозрачной (1,2 балла). Врастания сосудов в строму практически не отмечали (0,45 балла) (рис. 3и). Эпителиальный покров был гладким с блестящей поверхностью и флюоресцеином не окрашивался (рис. 3к). В контрольной группе помутнение стромы (7,15 баллов) и ее васкуляризация (1,25 балл) остались практически на прежнем уровне (рис. 3л). Эпителий роговицы был шероховат, умеренно отечен и неравномерно окрашивался 1,0% раствором флюоресцеина натрия (рис. 3м). В исходе заживления в результате проведенной импрессионной цитологии бокаловидные клетки были обнаружены только в эпителии роговиц контрольной группы животных, а в аналогичном эпителии основной группы их не оказалось.
При проведении статистического сравнения основной группы и контрольной по степени васкуляризации и степени прозрачности роговицы были выявлены статистически значимые различия (p<0,05) между этими группами.
Выводы
Таким образом, полученные в исследовании результаты показали, что культивированные на АМ аутологичные ЛЭСК полностью прижились на поверхности обнаженной стромы роговицы после их миграции с внутренней стороны амниотического трансплантата. Под покровом АМ они и обеспечили нормальную эпителизацию роговичной стромы, в пользу которой свидетельствовали гладкая блестящая поверхность эпителия, прозрачность эпителия и стромы, а также практически полная аваскулярность последней. С другой стороны, в контрольной группе трансплантат АМ, покрывавший роговицу, послужил субстратом для нарастания конъюнктивального эпителия, обеспечив ее полную конъюнктивализацию с формированием тотального фиброваскулярного паннуса. В пользу конъюнктивального фенотипа этого эпителия свидетельствовали его отечность, шероховатость и неравномерное остаточное окрашивание флюоресцеином. Приведенные клинические признаки были подтверждены импрессионной цитологией, показавшей отсутствие бокаловидных клеток в эпителии роговиц основной группы и их наличие в эпителии контрольной группы. Предлагаемая методика трансплантации АМ с культивированными на ее поверхности ЛЭСК обеспечивает восстановление нормального эпителиального покрова роговицы на глазах с тотальной лимбальной недостаточностью в эксперименте.
