Изменения экспрессии генов в сетчатке при интравитреальном введении VEGF в эксперименте

    Макулярный отек в результате нарушения проницаемости гематоретинального барьера достаточно часто является причиной слабовидения и потери зрения у лиц преимущественно трудоспособного возраста при такой патологии сетчатки, как диабетическая ретинопатия, влажная форма возрастной макулярной дегенерации и окклюзия вен сетчатки.

    В нарушении гематоретинального барьера при каждом из данных заболеваний важную роль играет васкулоэндотелиальный фактор роста (Vascular endothelial growth factor – VEGF) [21; 23; 45; 56; 65]. Современный уровень развития технологий позволяет на сегодняшний день проводить изучение молекулярно-генетических основ формирования патологии и идентифицировать ключевые регуляторные механизмы, участвующие в наступлении эффектов от проводимого лечения. Изучение молекулярных механизмов влияния VEGF на сетчатку позволит получить дополнительное представление не только о механизмах развития патологии, связанной с этим фактором, но и механизмах проведения лечения (анти-VEGF- терапия, лазеркоагуляция) и повышения его эффективности, поможет идентифицировать гены для разработки будущих терапевтических стратегий.

    Цель.

    Исследовать изменения экспрессии генов в сетчатке при интравитреальном введении VEGF в эксперименте.

    Материал и методы.

    Исследования проводили на 4-5-недельных самцах мышей линии C57BL/6J. Результаты исследования генотипа мыши свидетельствуют, что 80% генов этого животного и человека идентичны и 99% генов очень похожи, длина генетического кода мыши меньше, чем человека, всего лишь на 14% [16]. В связи с этим лабораторные мыши являются основной моделью для проведения биомедицинских исследований. При проведении исследований руководствовались требованиями «Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных». Все процедуры выполняли в соответствии с международными правилами обращения с животными (National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH Publications No. 80023, 1996).

    Под общим наркозом (внутрибрюшинная инъекция кетамина 100 мг/кг и ксилазина 5 мг/кг) с помощью шприца Hamilton было произведено интравитреальное введение рекомбинантного VEGF165 (R&D Systems) 50 нг/мл в 2 мкл фосфатно-солевого буферного раствора PBS (6 глаз), в контрольные глаза вводили PBS (6 глаз). Установлено, что через 24 часа после интравитреального введения 50 нг/мл VEGF животным сосудистая проницаемость увеличивается более чем в 3 раза [41; 53; 62; 76]. Через сутки после введения VEGF выделенные образцы тканей (нейроэпителий, пигментный эпителий) были переданы для транскрипционного анализа в ЗАО «Геноаналитика» (Москва).

    Суммарную РНК из выделенных образцов тканей экстрагировали с помощью реагента TRIzol (Invitrogen Life Technologies, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Количество полученной общей РНК оценивали с использованием спектрофотометра NanoDrop (NanoDrop Technologies, США) в соответствии с протоколом производителя. Качество РНК проверяли с помощью чипа Agilent Total RNA Nano 6000 (Agilent Technologies, США). По 400 нг общей РНК каждого образца амплифицировали с помощью Illumina® TotalPrep ^тм RNA Amplification Kit (Ambion, США). Амплифицированную РНК гибридизовали с MouseRef-8 v2.0 Expression BeadChips (Illumina) в соответствии с протоколом Illumina. Анализ полученных данных проводился с помощью программного обеспечения GenomeStudio (Illumina, США), модуля экспрессии генов. Для интерпретации результатов транскрипционного анализа использовали транскрипты с параметром Detection_Pval <0,01. Результаты считались значимыми при p<0,01.

    Результаты и обсуждение

    Регуляция экспрессии генов мембранных белков плотного контакта

    В результате проведенных исследований нами выявлено снижение экспрессии генов мембранных белков плотного контакта Ocln и Cldn -1, -2, -3, -5, -10, -11 и -19, которые экспрессируются в эндотелии сосудов сетчатки и пигментном эпителии и обеспечивают их барьерные функции [33; 42].

    В предыдущих экспериментальных работах было установлено, что в эндотелии сосудов сетчатки снижается экспрессия окклюдина и клаудинов -1 и -3 при использовании VEGF и при экспериментальном аутоиммунном ретините [18; 19; 75]. На модели кислород-индуцированной ретинопатии, наоборот, было выявлено, что экспрессия клаудинов -1, -2 и -5 увеличивается, и полученный результат авторы связывают с формированием неоваскуляризации [39]. На культуре фетальных клеток пигментного эпителия было установлено, что VEGF на экспрессию Cldn -3, -10 и -19 существенно не влияет [44]. При культивировании клеток пигментного эпителия в условиях высокой концентрации глюкозы и гипоксии снижается экспрессия окклюдина и клаудина -1 [70]. Полученные нами данные могут свидетельствовать о снижении экспрессии генов мембранных белков плотного контакта, как в эндотелии сосудов сетчатки, так и в пигментном эпителии.

    Обнаружено также, что экспрессия гена Ppap2b (Lpp3), который относится к мембранным гликопротеинам и отвечает за межклеточную адгезию эндотелиальных клеток, снизилась. Установлено, что при инактивации LPP3 в эндотелии сосудов сосудистая проницаемость увеличивается в 2 раза [43].

    Снизилась экспрессия генов Ndst1, кодирующего гепарансульфат и Hs3st3a1, отвечающего за биосинтез гепарансульфата – одного из компонентов эндотелиального гликокаликса, поддерживающего функции сосудистой стенки.

    В 8 раз увеличилась экспрессия гранулярного мембранного белка – гликопротеина 2 (Gp2), который активирует эндотелиальные клетки и снижает функции эндотелиального барьера.

    Регуляция экспрессии генов молекул межклеточной адгезии

    Экспрессия молекул межклеточной адгезии Icam-1 и -2 увеличилась в 2,1 и 5,2 раза, Vcam-1 – в 3,2 раза, CD44 – в 6 раз и хемокина Cx3cl1 – в 3,2 раза, что свидетельствует об усилении процессов межклеточных взаимодействий и клеточной адгезии.

    Роль молекулы CX3C, принадлежащей к подсемейству хемокинов в формировании сосудистой патологии сетчатки, меньше всего изучена, в связи с этим приводим данные только по данной молекуле. Установлено, что CX3CL1 стимулирует неоангиогенез у мышей с кислород-индуцированной ретинопатией, уровень его содержания увеличивается у пациентов в стекловидном теле при пролиферативной диабетической ретинопатии [78], у мышей с экспериментальным диабетом увеличивается уровень его экспрессии в сетчатке [54].

    Экспрессия гена St3gal6, который играет ключевую роль в синтезе сиалиллиганда клеточной адгезии E-селектина, выполняющего важную роль в инициации связывания лейкоцитов с эндотелием, снизилась.

    Регуляция неоангиогенеза

    Экспрессия генов Rhbdf1 увеличилась в 1,5 раза, а Psen2 – в 325 раз. Rhbdf1 принадлежит к семейству сериновых протеиназ (ромбоидов), расщепляющих белки, аналогичные эпидермальному фактору роста, и в связи с этим обладает антиангиогенными свойствами. Psen2 – пресенилин-2 относится к семейству аспартатных протеиназ, расщепляющих внутримембранные рецепторные белки 1 типа, и тоже обладает антиангиогенными свойствами, участвуя в реализации эффектов Notch сигнального пути, блокирующего ангиогенез. Установлено, что при повышении активности Notch сигнального пути формирование лазер-индуцированной хориоидальной неоваскуляризации блокируется и, наоборот, при его ингибировании активируется [7]. На модели кислород-индуцированной ретинопатии установлено, что в сетчатке увеличивается уровень экспрессии Psen2 [38] и Rhbdf1 [29].

    Тромбоспондин-1 – белок внеклеточного матрикса, ингибирует эндотелиальную клеточную пролиферацию, миграцию и ангиогенез. На модели кислород-индуцированной ретинопатии было установлено, что в период активного формирования неоваскуляризации в эндотелии ретинальных сосудов экспрессия TSP-1 увеличивается; при дополнительной VEGF-стимуляции наблюдается сначала снижение его экспрессии, затем, наоборот, увеличение в 3 раза по принципу отрицательной обратной связи [64]. По результатам наших исследований экспрессия Tsp1 увеличилась в 1,2 раза.

    Экспрессия гена Igfbp4 – ИФР – связывающего белки, типа 4, повысилась в 1,24 раза. Igfbp4 образует комплекс с инсулиноподобным фактором роста 1 и не позволяет ему связаться с «родными» рецепторами на клетках-мишенях, блокируя тем самым его эффект – стимулировать неоангиогенез. На экспериментальной модели кислород-индуцированной ретинопатии различными авторами было выявлено увеличение экспрессии в сетчатке различных типов ИФР – связующих белков. Одни авторы выявили увеличение экспрессии Igfbp2, Igfbp4 и Igfbp5 на фоне низкой экспрессии Igfbp3 и Igfbp6 [71], другие – увеличение экспрессии Igfbp3 более чем в 5 раз в областях формирования неоваскуляризации [35]. У пациентов с непролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией в стекловидном теле выявлено увеличение концентрации Igfbp2 и Igfbp3 в 1,5 и 13 раз соответственно [40; 46; 60].

    Экспрессия гена Irs2, кодирующего субстрат инсулинового рецептора 2 и участвующего в реализации физиологических функций инсулина и факторов роста [74], снизилась.

    Снизилась и экспрессия Egr1, участвующего в передаче сигналов VEGF-A/VEGFR2 и регуляции пролиферативных процессов в эндотелии, при его блокаде, с использованием NAB2, VEGF-индуцированная экспрессия генов в эндотелиальных клетках снижается и ангиогенез ингибируется [37; 52].

    Уридин-фосфорилаза входит в состав класса пиримидиновых нуклеозидфосфорилаз, катализирует реакцию расщепления гликозидной связи в уридине и обладает выраженными проангиогенными свойствами. Установлено, что в результате блокады уридин-фосфорилазы блокируется лазер-индуцированная хориоидальная неоваскуляризация [77].

    Нами установлено, что экспрессия уридин-фосфорилазы 1 (Upp1) увеличилась в 2,6 раза.

    Регуляция структурных клеточных функций

    Экспрессия 7 генов из семейства промежуточных цитоскелетных филаментов (Krt 17 – повысилась в 4,8 раза, Krt 19, Krt 13, Krt 23, Krt 15, Krt 14 и Krt 6b) повысилась в 3,0, 2,7, 2,5, 2,3, 2,2 и 1,5 раза соответственно.

    Промежуточные филаменты играют важную роль в поддержании структурной целостности внутренних слоев сетчатки, особенно клеток Мюллера. При аргон-лазерной коагуляции сетчатки в ганглиозном слое и слое нервных волокон выявлено повышение уровня экспрессии Krt 1-12 [13]. В сетчатке крыс OXYS (преждевременно стареющие крысы) в возрасте 3 мес. экспрессия Krt 1-12, наоборот, снижается, что с точки зрения автора свидетельствует о нарушении взаимодействий между клетками и внеклеточным матриксом [4].

    Уровень экспрессии муцина 1 (Muc1) – трансмембранного гликопротеина, входящего в состав волокон клеток Мюллера, формирующих наружную и внутреннюю пограничные мембраны и выполняющего функции клеточного протектора, повысился в 3,1 раза [67].

    Экспрессия гена ядерной ламины (фибриллярный белок) (Lmna), обеспечивающего структурную функцию, увеличилась.

    Кальпаины – Са2+-зависимые цистеиновые протеиназы, осуществляют деградацию белков, являющихся компонентами цитоскелета [4]. Содержатся в нервной ткани в двух формах – растворимой и мембраносвязанной, которая преимущественно ассоциирована с миелином и обнаруживается в синаптических мембранах, расщепляет большинство белков цитоскелета и нейрофиламентов, белки микротрубочек, основной белок миелина, глиальный фибриллярный кислый белок, тубулин, спектрин и миофибриллярные белки. Экспрессия кальпаина 1 (Capns1) по нашим данным увеличилась в 1,75 раза, установлена его связь с нейродегенеративными процессами и пигментным ретинитом.

    Функция кристаллинов Сryga, Сrygс, Сrygn, Сrygf и Сryge, относящихся к группе структурных генов, заключается в защите белков от неправильного сворачивания и аггрегации, т.е. они являются шаперонами. На экспериментальных моделях глаукомы было выявлено наличие снижения экспрессии белков-кристаллинов в сетчатке [8; 47; 61], в сетчатке крыс OXYS экспрессия кристаллинов Сrygb, Crygs, Cryab, Cryba2 и Crygd снижается в 10 раз [4]. На моделях животных при лазерной коагуляции сетчатки, повреждении зрительного нерва и стрептозотоциновом диабете выявлено, наоборот, повышение экспрессии кристаллинов [13; 28; 51; 72]. Xi J. с соавт. [73] и Templeton J.P. с соавт. [66] считают, что интерпретировать различия в экспрессии кристаллина в сетчатке следует с осторожностью, так как они значительно варьируются и зависят от инициирующего стимула.

    Регуляция процессов клеточной пролиферации транскрипции (построение РНК по комплементарной ДНК) и дифференциации

    В обеспечении скоординированного баланса между процессами клеточной пролиферации и дифференциации важную роль играет Hippo-киназный сигнальный путь, одним из компонентов которого является Sav1 (гомолог Салвадор 1, известный также как WW45), находящийся, как и большинство других компонентов этого пути, в «спящем» состоянии во взрослом организме. Hippo-киназный сигнальный путь играет решающую роль в процессе ретиногенеза – при активации пролонгирует пролиферацию клеток-предшественников, при дезактивации блокирует [12]. Однако есть данные, что Sav1 может инициировать процесс пролиферации взрослых кардиомиоцитов и усиливать регенерацию кардиомиоцитов после инфаркта миокарда [26; 27]. В нашем случае экспрессия Sav1 снизилась.

    Снизилась и экспрессия генов супрессоров клеточной пролиферации – некдина (Ndn) и фосфатидилинозитола – 5-фосфата – 4-киназы (Pip4k2f) и гена супрессора клеточного деления – Fnip1. Увеличилась экспрессия ингибитора орнитин декарбоксилазы (Oaz1), блокирующего синтез полиаминов, ингибирующего процессы клеточной пролиферации и роста [49] в 1,9 раза.

    В 2,1 раза увеличилась экспрессия лизоцима (Lyzs), обычно находящегося в «спящем» состоянии [59], и в 2 раза – экспрессия гена активатора транскрипции – фактора Hes1 (Hes1), экспрессируемого обычно в клетках-предшественниках и участвующего в регуляции морфогенеза сетчатки, клеточного цикла и клеточной дифференцировки [22].

    Экспрессия генов активаторов транскрипции – Atmin и Lbh-гена, кодирующего LBH транскрипционный активатор и являющегося регулятором дифференциации фоторецепторов через Otx2 [34] и гена спектрина – бета 1 (Spnb1), участвующего в регуляции процессов транскрипции и дифференциации, снизилась. В отличие от полученных нами данных, на модели кислород-индуцированной ретинопатии было выявлено, что экспрессия гена Spnb1 в сетчатке увеличивается [29].

    Снизилась экспрессия Prox1 – транскрипционного фактора, индуцирующего пролиферацию и дифференцировку биполярных, амакринных и горизонтальных клеток сетчатки в период внутриутробного развития. Снизилась экспрессия гена Egr1, который помимо регуляции пролиферативных процессов в эндотелии, являясь транскрипционным фактором, играет важную роль в нейрональной активности и пластичности [31]. Повышение уровня его экспрессии в сетчатке, выявленное на стрептозотоциновой модели сахарного диабета, свидетельствует о его роли в активации микроглии [20]. Экспрессия генов-гистонов (Hist1h2bf, Hist1h2bj) – ядерных белков, ингибирующих транскрипцию РНК, повысилась в 1,4 раза. На экспериментальной модели кислород-индуцированной ретинопатии было установлено, что в сетчатке снижается экспрессия генов Hist1h2bk, Hist1h2bc, Hist1h2bp, Hist1h2bl, Hist1h2bj, Hist1h2bm, Hist1h2bn [29].

    Регуляция процессов трансляции (синтез белка из аминокислот на матрице информационной, матричной РНК) и процессинга РНК (процесс созревания синтезированной на ДНК преРНК и преобразование её в зрелую РНК)

    Действие антисмысловых РНК направлено против функционирования кодирующих (осмысленных) РНК, в связи с этим они получили название антисмысловых (antisense RNA) или micРНК (mRNA interfering complementary RNA – IncRNA). Антисмысловые РНК образуют гибридные комплексы с комплементарными мРНК и препятствуют формированию трансляционного комплекса [69]. Многочисленные IncRNA играют значительную роль в процессе развития сетчатки [17]. Six3os экспрессируется в клетках-предшественниках сетчатки мыши и человека и контролирует экспрессию фактора транскрипции Six3. Подавление его экспрессии приводит к уменьшению количества биполярных клеток и увеличению количества глиальных клеток Мюллера [10; 14; 50; 79; 80]. Gomafu в процессе развития сетчатки регулирует количество формирования амакриновых и глиальных клеток Мюллера [50]. Экспрессия ингибитора трансляции (Gm11961) – антисмысловой РНК – увеличилась в 1,8 раза.

    Экспрессия гена Prpf19, отвечающего за процессинг РНК, увеличилась в 1,3 раза, и одновременно снизилась экспрессия Sentrin/SUMO специфической протеиназы 3 (Senp3), участвующей в созревании рРНК, SUMO модулирует многие пути передачи сигнала (Wnt, цитокины, ростовые факторы, стероидные гормоны) [1].

    Снизилась экспрессия генов Pabpn1 и A2bp1, относящихся к классу РНК-связывающих белков, которые соединяются с большим количеством белков-партнеров и практически со всеми мРНК (осуществляют транспорт мРНК в цитоплазму, проверку ее на «значимость» и определяют путь дальнейших преобразований – деградация, трансляция и ее регуляция) [3].

    Регуляция процессов трансмембранного переноса белков и микроэлементов

    Экспрессия гена связанного мембранного белка 1 (Tram1), отвечающего за транслокацию (перенос) белков через мембрану, повысилась в 1,5 раза.

    Увеличилась экспрессия гена, содержащего NIPA-подобный домен 1 (Npal2), отвечающего за трансмембранный перенос малых молекул и гена, отвечающего за ретроградный транспорт эндосом, окислительный стресс и участвующего в формировании аутосомно-доминантной семейной экссудативной витреоретинопатии (Plekhb2) в 1,5 раза.

    Снизилась экспрессия гена Bdh2 (в большом количестве экспрессируется в пигментном эпителии, клетках Мюллера и ганглиозных клетках сетчатки) – ингибитора выработки эндогенной 2,5-дигидроксибензойной кислоты, обеспечивающей трансмебранный (плазматическая и митохондриальная мембраны) перенос железа. Железо участвует в метаболизме холестерина в пигментном эпителии сетчатки и играет роль в формировании возрастной макулярной дегенерации. Установлено, что у мышей с дефицитом протеина HFE (гемохроматоз) снижается экспрессия Bdh2 в клетках сетчатки и увеличивается содержание холестерина [11].

    Экспрессия гена Ccs, выполняющего шаперонную функцию – несущего ответственность за поставку меди в супероксиддисмутазу (СОД), снизилась. При снижении экспрессии Ccs активность СОД снижается на 70-90%. Регуляция процесса передачи сигнала (сигналинг)

    Регуляция процесса передачи сигнала (сигналинг)

    Нами установлено увеличение экспрессии гена миелоидной дифференцировки Myd88 в 1,36 раза. Myd88 является цитозольным адаптерным белком, участвующим в передаче сигнала от всех толл-подобных рецепторов (Toll-like receptor, TLR) за исключением TLR3 [36]. В результате экспериментальных исследований было также установлено, что ингибирование Myd88 в пигментном эпителии сетчатки мышей дает положительный результат в лечении сухой формы дистрофии сетчатки.

    Экспрессия гена кальмомодулина 3 (Calm3), кальций-зависимого сигнального белка, увеличилась в 1,29 раза, и незначительно повысилась экспрессия генов, связанных с клеточным сигналингом – Wbpil и Smad4.

    Регуляция процессов протеолиза (экстраклеточного, цитоплазматического, протеасомного, лизосомального) и гидролиза

    Протеасомный (убиквитин-протеасомный) протеолиз – это одна из систем внутриклеточной деградации белков, конъюгированных с убиквитином, участвующих во множестве клеточных процессов, включая регуляцию транскрипции, репарацию ДНК, иммунный ответ и апоптоз [5; 6]. Согласно современным представлениям, протеасомы находятся не только в клетке (ядро, цитоплазма), но и во внеклеточном пространстве. Предполагается, что накопление их в межклеточном пространстве связано с необходимостью «расчистки территории» – избавления от накапливающихся во внеклеточном пространстве белков [9; 58]. За протеасомный протеолиз отвечает многочисленное число генов – Psma6, Psma7, Psma6, Psma7, Psma9 и Psmd13.

    Нами установлено увеличение экспрессии гена экстраклеточного протеолиза – матричной металлопротеиназы (Mmp3), отвечающей за деградацию внеклеточного матрикса в 2 раза, цитоплазматического протеолиза – убиквилина 1 (Ubqln1) (повышает риск развития болезни Альцгеймера) в 1,45 раза и гена протеасомного протеолиза (Psmd6) в 1,36 раза, и снизилась экспрессия гена цитоплазматического убиквитин-протеолиза – Ubeo2o.

    Экспрессия генов, отвечающих за лизосомальный протеолиз – гюкозидазы (Gaa) – увеличилась в 1,95 раза, лизоцима – аутофагия (Lyzs) – в 1,7 раза (установлена связь лизоцима с нейродегенеративными заболеваниями сетчатки) и маннозидазы (Man2b1) в 1,6 раза.

    Экспрессия генов, ингибирующих протеолиз, ингибитора трансмембранных сериновых протеиназ (Serpinb3a), одновременно увеличилась в 3,1 раза, ингибитора цистеиновых протеиназ (Stfa1 и Wfdc2) – в 1,9 раза и ингибитора пептидазы 16 (Pi16) – в 1,8 раза. Снизилась экспрессия гена Ulk1 – индуктора процессов аутофагии.

    Установлено также увеличение экспрессии гена, отвечающего за цитоплазматический гидролиз (Ndrg3) в 1,7 раза.

    Эндогенные альдегиды образуются в процессе перекисного окисления липидов, гликозилирования и окисления радикалов некоторых свободных аминокислот, обладают высокой цитотоксичностью – формируют ковалентно связанные белки – «вторичные цитотоксические мессенджеры» (при взаимодействии альдегидов с аминогруппами лизина формируется липофусцин), которые за счет ингибирования протеолитической активности протеасом (убиквит-зависимый протеолиз) плохо подвергаются протеолизу и накапливаются в клетках, взаимодействуя с мембранами митохондрий, тормозят окислительно-восстановительные процессы в дыхательной цепи митохондрий и угнетают тканевое дыхание. К ферментам, катализирующим процесс катаболизма альдегидов, относятся глутатионтрансфераза и альдозоредуктаза, альдегиддегидрогеназа и альдегидредуктаза [2]. Таким образом, в результате снижения экспрессии Lос100044692 нарушается утилизация эндогенных альдегидов.

    Нами установлено снижение экспрессии гена Lос100044692.

    Регуляция процесса синаптической передачи

    Оксистеролы образуются в синаптических мембранах в результате окислительной модификации холестерина, «покидают» мембраны, связываясь с оксистерол-связывающими белками. Увеличилась экспрессия гена Cинаптотагмин I (Syt1) – мембранного белка синаптических везикул, отвечающего за синаптическую передачу [32; 57; 63], способствующего аксональному разветвлению [25] и участвующего в регенерации аксонов [68] в 1,24 раза. На модели аксональной травмы (краш-синдром) зрительного нерва мышей было установлено, что после травмы увеличивается экспрессия Syt1, авторы предполагают, что индукция экспрессии Syt1 может быть обусловлена регенеративной недостаточностью [55].

    Нами установлено повышение экспрессии гена Cd63 (трансмембранный белок), отвечающего за экзоцитоз синаптических везикул в 1,43 раза и гена оксистерол-связывающего белка 2 (Osbp2) – одного из ключевых ферментов холестеринового обмена, участвующего в поддержании липидного состава мембран, связывающего оксистеролы и ингибирующего их цитотоксичность в 1,3 раза.

    Экспрессия гена Syap1 – cинапс-ассоциированного белка 1, отвечающего за синаптическую передачу и гена Trpm3, играющего важную роль в передаче сигналов во внутренних слоях сетчатки, снизилась [15; 24].

    Регуляция митохондриальных функций

    Установлено увеличение экспрессии сигнальной митохондриальной пептидазы – ген Sec11a – в 1,5 раза. Одновременно снизилась экспрессия гена Atp5c1, кодирующего субъединицу митохондриальной АТФ-синтазы – катализатора синтеза АТФ, и гена Atpif1, кодирующего ингибитор митохондриальной АТФ-азы – катализатора отщепления от аденозинтрифосфорной кислоты остатков фосфорной кислоты с освобождением энергии, используемой в процессах трансмембранного переноса и биосинтеза различных соединений, что свидетельствует о нарушении энергетического метаболизма.

    Снизилась экспрессия гена, ответственного за высокую точность воспроизведения генетически заданной структуры белков – гена, кодирующего митохондриальный фермент – фенилаланилтРНК синтетазу (Fars2), и снизилась экспрессия гена Chchd1, кодирующего белок миторибосом (рибосом митохондрий).

    Регуляция метаболических процессов

    Уровень экспрессии гена цитохрома P450 (Сyp2a5), отвечающего за процессы окисления, гидроксилирования, метаболизма ретинола (катализатор окисления ретиноевой кислоты в 4-гидрокси-ретиноевую кислоту), повысился в 4,0 раза.

    Экспрессия гена фосфатазы 1 (Ppp1ca) в 1,32 раза, участвующего в регуляции различных метаболических процессов, повысилась. Установлено также, что после экспериментального лигирования центральной артерии сетчатки у крысы увеличивается уровень экспрессии Ppp1ca, Ppp3r1 и Ppp1cc [48].

    Экспрессия гена орнитин-аминотрансферазы (Oat), катализирующей трансаминирование орнитина и альфа-кетоглутарата в пиролин-5-карбоксилат, глутамин или пролин, увеличилась в 1,5 раза; при дефиците орнитин-аминотрансферазы развивается прогрессирующая хориоретинальная дистрофия Gyrate [30].

    Снизилась экспрессия гена Gldc (декарбоксилаза глицина), катализирующего образование глицина из глиоксилата. Экспрессия Gldc в ткани сетчатки увеличивается при стрептозотоциновом сахарном диабете [20].

    Регуляция экспрессии факторов роста и стресс-белков (белки острой фазы воспаления)

    Экспрессия гена Ngfrap1 – белка рецептора фактора роста нервов, являющегося низкоаффинным рецептором нейротрофинов (NGF, BDNF, NT3, NT4) и играющего важную роль в регулировке активности нейротрофиновых Trk-рецепторов, снизилась.

    Нами также установлено, что уровень экспрессии лактоферрина (Ltf), который является белком острой фазы воспаления и регулирует функции иммунокомпетентных клеток, повысился в 3,7 раза.

    Выводы

    Таким образом, при интравитреальном введении VEGF:

    • нарушается барьерная функция эндотелия сосудов сетчатки за счет снижения экспрессии генов мембранных белков плотного контакта (Ocln и Cldn -1, -2, -3, -5, -10, -11 и -19), генов, которые относятся к мембранным гликопротеинам (Ppap2b) и отвечают за биосинтез гепарансульфата (Ndst1, Hs3st3a1) – одного из компонентов эндотелиального гликокаликса, поддерживающего функции сосудистой стенки; за счет увеличения экспрессии гена Gp2, снижающего функции эндотелиального барьера и молекул межклеточной адгезии (Icam-1, -2, Vcam-1, CD44, Cx3cl1в); снижение экспрессии гена St3gal6, участвующего в синтезе лиганда клеточной адгезии E-селектина, вероятно, является компенсаторным;

    • меняется экспрессия генов, участвующих в регуляции процесса неоангиогенеза – с одной стороны, компенсаторно увеличивается экспрессия генов – ингибиторов неоваскуляризации (Psen2, Rhbdf1, Tsp1, Igfbp4), и снижается экспрессия генов, стимулирующих ангиогенез – Irs2 и Egr1, с другой стороны, увеличивается экспрессия гена Upp1, обладающего проангиогенными свойствами;

    • активируется экспрессия генов из семейства промежуточных цитоскелетных филаментов (Krt 17, Krt 19, Krt 13, Krt 23, Krt 15, Krt 14, Krt 6b), клеточного протектора Muc1 и ядерного фибриллярного белка Lmna, обеспечивающих поддерживающую структурную функцию, и снижается экспрессия Capns1, участвующего в деградации белков – компонентов цитоскелета, одновременно при этом снижается экспрессия белков-кристаллинов (Сryga, Сrygс, Сrygn, Сrygf, Сryge), относящихся также к группе структурных генов;

    • снижается экспрессия генов – супрессоров клеточной пролиферации (Sav1, Ndn, Pip4k2f, Fnip1) и увеличивается экспрессия гена Oaz1 – ингибитора клеточной пролиферации;

    • увеличивается экспрессия генов, имеющих отношение к клеточной дифференцировке (Lyzs, Hes1), находящихся обычно во взрослом организме в «спящем» состоянии; блокируются процессы транскрипции за счет снижения экспрессии генов активаторов транскрипции (Atmin, Lbh, Spnb1, Prox1, Egr1) и увеличения экспрессии генов гистонов (Hist1h2bf, Hist1h2bj) – ингибиторов транскрипции;

    • увеличивается экспрессия ингибитора трансляции – Gm11961 – антисмысловой РНК и регулируется процесс созревания РНК – увеличивается экспрессия гена Prpf19 и снижается экспрессия Senp3, Pabpn1 и A2bp1с;

    • активируется экспрессия генов, отвечающих за трансмембранный перенос белков – Tram1, малых молекул – Npal2, за ретроградный транспорт эндосом – Plekhb2 и снижается экспрессия гена Bdh2 – ингибитора трансмембранного переноса железа (активируется перенос железа) и гена Ccs, отвечающего за поставку меди в СОД (снижается активность фермента);

    • активируется процесс передачи сигнала – повышается экспрессия генов – Myd88, Calm3, Wbpil и Smad4;

    • увеличивается экспрессия генов, отвечающих за экстраклеточный (Mmp3), цитоплазматический (Ubqln1), протеасомный (Psmd6) и лизосомальный (Gaa, Lyzs, Man2b1) протеолиз и гена, активирующего цитоплазматический гидролиз (Ndrg3); одновременно снижается экспрессия гена, отвечающего за цитоплазматический протеолиз – Ubeo2o, индуктора процессов аутофагии – Ulk1, и увеличивается экспрессия генов, ингибирующих протеолиз – Serpinb3a, Stfa1, Wfdc2, Pi16 и Lос100044692;

    • регулируется процесс синаптической передачи – одновременно увеличивается – Cd63, Osbp2, Syt1 и снижается – Syap1, Trpm3 экспрессия генов, отвечающих за синаптическую передачу;

    • регулируются митохондриальные функции – увеличивается экспрессия гена сигнальной митохондриальной пептидазы – Sec11a, снижается экспрессия генов митохондриальной АТФ-синтазы – Atp5c1, ингибитора митохондриальной АТФ-азы – Atpif1, фенилаланил-тРНК синтетазы – Fars2 – и гена белка миторибосом Chchd1;

    • активируется экспрессия генов, отвечающих за метаболизм – Oat, Ppp1ca и Сyp2a5 (метаболизм ретинола) и снижается экспрессия гена, катализирующего образование глицина – Gldc;

    • снижается экспрессия гена Ngfrap1 – белка рецептора фактора роста нервов и повышается уровень экспрессии стресс-белка – лактоферрина (Ltf), регулирующего функции иммунокомпетентных клеток.

    Васкулоэндотелиальный фактор роста, таким образом, помимо того, что играет важную роль в нарушении функции гематоретинального барьера, обладает еще целым рядом эффектов, представление о которых необходимо иметь на сегодняшний день для повышения эффективности лечения офтальмопатологии, сопровождающейся формированием макулярного отека.

    

    Сведения об авторах

    Гаврилова Наталья Александровна – док. мед. наук, профессор, зав. кафедрой глазных болезней Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова.

    Борзенок Сергей Анатольевич – док. мед. наук, профессор кафедры глазных болезней Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова, руководитель Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РФ.

    Обрубов Сергей Анатольевич – док. мед. наук, профессор кафедры офтальмологии педиатрического факультета ГБОУ ВПО ««РНИМУ им. Н.И. Пирогова»» Минздрава России.

    Гаджиева Нурия Саниевна – доцент кафедры глазных болезней Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова.

    Комова Ольга Юрьевна – ассистент кафедры глазных болезней Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова.