Изучение антиоксидантной активности роговицы при различных методиках кросслинкинга роговичного коллагена в эксперименте

     В настоящее время для лечения кератоэктазий успешно применяется ультрафиолетовый (УФ) кросслинкинг роговицы (КЛР), при котором укрепляющий эффект роговицы возникает посредством перекрестного «сшивания» коллагена за счет образования новых химических связей при инициации свободно-радикальных процессов, активируемых УФ излучением (370 нм) в присутствии рибофлавина [1]. Сшивание корнеальных коллагеновых волокон происходит при комбинированном воздействии на роговицу рибофлавина и ультрафиолетового излучения длиной волны 370 нм. Фотохимическая реакция приводит к увеличению толщины коллагеновых фибрилл стромы и повышению жесткости роговицы [2, 3]. Основной целью данной процедуры является остановка прогрессирования заболевания, которая, по данным различных авторов, достигается в 66,7-91,9% случаев [4, 5].

    На сегодняшний день продолжается процесс непрерывного совершенствования этой уникальной технологии, направленный на снижение побочных эффектов процедуры, в частности, связанных с послеоперационным лакунарным отеком, обусловленным избыточной активацией апоптоза кератоцитов. Одной из таких новаций является внедрение импульсного кросслинкинга, при котором УФ облучение роговицы производится в результате чередующихся засветов и пауз.

    Цель

    Сравнительное изучение в эксперименте антиоксидантной активности во влаге передней камеры и гомогенатах роговиц кроликов при различных методиках ультрафиолетового (УФ) кросслинкинга.

    Материал и методы

    Эксперименты проведены на 24 глазах (12 животных) кроликов-самцов породы «Шиншилла». Нами выделены 4 исследуемые группы (по 6 глаз в каждой). В 1 группе роговица не подвергалась воздействию ультрафиолетового излучения. В опытных же группах был проведен кросслинкинг роговицы различными методиками: во 2 группе – по стандартной методике (s-CXL) при мощности излучения 3 мВт/см² в течение 30 минут, в 3 – ускоренный кросслинкинг (акселерированный, a-CXL) при мощности 18 мВт/см² и времени воздействия 5 минут, в 4 – импульсный кросслинкинг (i-CXL) при аналогичной мощности 18 мВт/см² в течение 10 минут (в режиме 1 сек. засвет / 1 сек. пауза). Забор влаги передней камеры (ВПК) и изъятие роговиц производили в сроки – через 1 час, на 1 и 4 сутки после процедуры.

    В качестве анестезиологического пособия применяли внутримышечный наркоз ксилазина гидрохлорида («Ксила», Нидерланды) в дозе 20 мг/кг и местные инстилляции 0,4% раствора оксибупрокаина («Инокаин», Индия).

    Во всех группах до процедуры УФ кросслинкинга выполняли деэпителизацию роговицы диаметром около 9 мм. Насыщение стромы роговицы проводили посредством инстилляций раствора «Декстралинк» (Россия) в течение 30 минут до УФ-облучения и в процессе его из расчёта 1 капля в минуту.

    Методами люминолзависимой хемилюминесценции исследовали интенсивность образования активных форм кислорода (АФК) во ВПК глаза и железоиндуцированной хемилюминесценции – активность процессов свободно-радикального окисления (СРО) в супернатантах гомогенатов роговиц кроликов. Оценку продукции АФК и интенсивности процессов СРО проводили по данным светосуммы хемилюминесценции, выражаемым в условных единицах, с использованием хемилюминометра ХЛМ-003 (Россия) [6].

    Оценка общего антиоксидантного статуса (ОАС) переднекамерной влаги кролика проводилась с использованием тест-систем «Total antioxidant status» (Randox Laboratories Ltd., Великобритания) на фотометре SF-Ultra (Россия).

    Полученные числовые данные подвергали статистической обработке с помощью лицензированного статистического пакета программ STATISTICA v.6.1.

    Результаты и обсуждение

     Светосумма люминолзависимой (ЛЗ) хемилюменисценции (ХЛ) ВПК кроликов в опытных группах (2, 3, 4) превышала значения контроля через 1 час, на 1 и 4 сутки после процедуры, что свидетельствовало об усилении образования активных форм кислорода в тканях роговицы, вследствие рибофлавин-УФ-ассоциированного воздействия на неё. Через 1 час после процедуры значения светосуммы во всех исследуемых группах незначительно отличались от контроля, что связано с присутствием в модельной системе следов рибофлавина из образцов ВПК.

    При этом максимальные значения светосуммы ЛЗ ХЛ в опытных группах отмечались через сутки после КЛР со статистически значимой разницей во 2 группе (s-CXL), где рост показателя составил 40% (р< 0,05) в сравнении с контролем. На четвертые сутки наблюдали восстановление исследуемых параметров во всех опытных группах (рис. 1). Как видно из данных рисунка 1, значения светосуммы ЛЗ ХЛ и, соответственно, активность образования АФК после импульсного кросслинкинга роговицы (группа 4) в течение всего срока наблюдения была наименьшей.

    Динамика изменений светосуммы железоиндуцированной (ЖИ) хемилюминесценции супернатантов из гомогенатов роговиц кроликов также характеризовалась ее ростом в указанные сроки наблюдения, что свидетельствовало об активации процессов СРО в роговице после использования различных техник УФ кросслинкинга (рис. 2). Статистически значимые отличия показателя, превышающие норму, регистрировались через сутки в группах после стандартного (s-CXL) – на 101% (p< 0,05) и ускоренного кросслинкинга (а-CXL) – на 97% (p< 0,05) с последующим их снижением к завершению эксперимента.

    В роговицах животных после импульсного кросслинкинга (4 группа) активация свободно-радикальных процессов, как и интенсивность образования АФК, была менее выраженной в сравнении со значениями 2 и 3 групп.

    Важным УФ-индуцированным критерием, ассоциированным с усиленным образованием активных форм кислорода и ростом интенсивности процессов свободно-радикального окисления в тканях глаза, является оценка общего антиоксидантного статуса (ОАС) переднекамерной влаги животных. Так, во всех группах животных отмечали снижение ОАС влаги передней камеры в указанные сроки наблюдений: через сутки после процедуры общий антиоксидантный статус ВПК кроликов был достоверно снижен на 54-63% (p< 0,05) (табл.).

    На 4 сутки отмечали незначительную тенденцию к восстановлению антиоксидантной системы во всех исследуемых группах, однако, при импульсном режиме КЛР исследуемый показатель был наиболее близким к значениям интактных животных.

    Выявленные особенности снижения уровня общего антиоксидантного статуса ВПК глаза демонстрируют закономерную зависимость от роста интенсивности свободно-радикальных процессов и повышения продукции АФК в тканях роговицы после рибофлавин-УФ воздействия. Важно отметить, что импульсный кросслинкинг роговицы способствовал ее менее выраженному окислительному стрессу.

    Выводы

    1. Сравнительный анализ параметров светосуммы люминолзависимой хемилюминесценции влаги передней камеры и железоиндуцированной хемилюминесценции супернатантов гомогенатов роговиц кроликов после ультрафиолетового кросслинкинга роговицы стандартным, акселерированным и импульсным способами выявил рост данных показателей в раннем послеоперационном периоде, что свидетельствует об усилении образования активных форм кислорода и интенсификации процессов свободно-радикального окисления в тканях глаза.

    2. Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы различными методиками (стандартная, акселерированная и импульсная) вызывает снижение общего антиоксидантного статуса переднекамерной влаги экспериментальных животных в срок до 4 суток после процедуры.

    3. Наиболее низкий уровень исследованных параметров люминолзависимой и железоиндуцированной хемилюминесценции, наряду с максимальными значениями общего антиоксидантного статуса зарегистрированы у животных после импульсного ультрафиолетового кросслинкинга роговицы, что является важными критериями снижения АФК-опосредованных побочных эффектов в послеоперационном периоде.