Изучение экспериментальных методов выделения и культивирования клеток эндотелия роговицы человека

    Актуальность

     Задний эпителий (эндотелий) роговицы человека представлен монослоем клеток гексагональной формы, расположенных на внутренней поверхности роговицы. Он играет важнейшую роль в реализации гидробаланса роговицы, регулируя приток водянистой влаги к строме, обеспечивая тем самым ее прозрачность [1]. При этом потенциал обновления клеток эндотелия роговицы ограничен естественными механизмами, и восстановление целостности монослоя возможно преимущественно за счет клеточной миграции и растяжения клеток [4, 9]. Это обусловливает тот факт, что в случае значительного повреждения эндотелиального слоя роговицы у человека при различных условиях формируется дисфункция слоя, отек стромы и, как следствие, утрата прозрачности роговицы. На текущий момент основными способами лечения дисфункции эндотелия роговицы человека являются сквозная кератопластика (СКП) и селективные трансплантации эндотелиального слоя: (эндотелиальная кератопластика с удалением Десцеметовой мембраны [15], эндотелиальная кератопластика Десцеметовой мембраны [14], перенос донорской Десцеметовой мембраны с эндотелием [7, 13]) [3, 5, 8]. Наличие дефицита донорских роговиц препятствует широкому распространению данных операций. Помимо этого, данные методики, как любые сложные вмешательства, требуют наличия подходящей инфраструктуры и высокой квалификации хирурга для проведения данных операций. Такие операции, даже при выполнении их в оптимальных условиях, сопровождаются возникновением ряда осложнений: отслойки трансплантата, воспаления, вызванного инфицированием, или иммунного отторжения. В связи с этим использование клеточной терапии представляется как вариант решения данной проблемы.

    Разработка метода воспроизведения жизнеспособных клеток эндотелия роговицы человека in vitro является важнейшей задачей в экспериментальной офтальмологии на протяжении последних тридцати лет. Трудности в культивировании связаны с блокированием клеточного цикла эндотелиальных клеток роговицы в постмитотической фазе как in vitro, так и in vivo. Имеются данные экспериментов, указывающие на то, что задержка клеток в фазе G1 клеточного цикла связана с контактным торможением и экспрессией трансформирующего фактора роста β, а также нехваткой паракринной стимуляции факторами роста для перехода клеток из фазы G1 в фазу S клеточного цикла [10]. Таким образом, этап выделения при культивировании клеток эндотелия роговицы человека несет в себе задачу не только изолировать клетки и перенести их в ростовую среду, но и простимулировать их деление. Предыдущие попытки стимуляции деления клеток осуществлялись путем механического воздействия или выделения клеток раствором диспазы/трипсина/этилен-диаминтетрауксусной кислоты и показали, что эти методы наряду со стимулированием пролиферации приводят к эпителиально-мезенхимальной транзиции клеток и потере характерного гексагонального клеточного фенотипа [6, 12].

    Изменения, происходящие при эпителиально-мезенхимальной транзиции, затрагивают все уровни организации клетки. Первоначально меняется экспрессия ряда генов, что ведет к реорганизации и изменению функционирования внутриклеточных структур с последующими изменениями морфологии клеток и, как следствие, их функциональных свойств [2]. Отсутствие данных о степени выраженности эпителиально-мезенхимальной транзиции и наличие данных об улучшении адгезии клеток к поверхности культивирования являются факторами в пользу изучения методики изоляции клеток данного вида с использованием коллагеназы. Способность дезагрегировать клетки и небольшое количество данных об использовании данного фермента для изоляции клеток эндотелия роговицы человека делают текущий эксперимент актуальным. Помимо этого, использование данной методики культивирования видится актуальным ввиду различия сред, используемых в опытах, описанных в литературе.

    Цель

    Разработать ферментативный метод выделения клеток эндотелия роговицы из кадаверных глаз человека.

    Материал и методы

    В исследовании использовались корнеосклеральные диски, считающиеся непригодными для использования при трансплантации роговицы. Корнеосклеральные диски были выделены из 4 глаз 2 трупов доноров 57 и 63 лет и предоставлены Глазным тканевым банком «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. Комплекс клеток эндотелия роговицы человека с Десцеметовой мембраной был выделен из склерально-роговичных фрагментов при помощи скальпеля и пинцета под микроскопом с отступом 2 мм от линии Швальбе. Образцы случайным образом разделили на две группы. В первой – “комплекс” подвергали ферментативной дезагрегации в растворе коллагеназы типа (2 мг/мл) в среде DMEM/F12, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки в течение 30 минут при 37°С при постоянном помешивании. Отмытую суспензию переносили в чашки Петри 35 мм (SPL). В качестве контроля образцы второй группы помещали в чашки Петри 35 мм (SPL) без обработки. Культивирование в обеих группах проводилось в среде с добавлением DMEM F12/199 = 1:1, 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% раствора антибиотиков, L-глютамина – 6 ммоль/мл, фактора роста фибробластов – 10 нг/мл, гепарина, фактора роста эндотелия – 5 нг/мл, при стандартных условиях. Смену среды проводили каждые 2 суток. При достижении монослоем клеток 80-90% конфлуэнтности осуществляли пассирование культуры c использованием раствора трипсина. Плотность клеток при рассеве составляла не менее 300000 кл/мл. Подсчет клеток при пассировании культуры производили с использованием камеры Горяева. Фазово-контрастный контроль и подсчет количества клеток в ходе культивирования осуществлялся на инвертированном микроскопе «ix81 Olympus». Изучались процессы поведения клеток эндотелия на сроках культивирования до 2 месяцев, а также их эпителиально-мезенхимальная пластичность.

    Выводы

    Группа клеток, претерпевших ферментативное воздействие в ходе культивирования, отличалась высокой скоростью адгезии к стандартной культуральной поверхности в сравнении с контрольной группой. Данный факт, вероятно, связан со способностью коллагеназы селективно расщеплять интерстициальный коллаген, не воздействуя на коллаген, находящийся в составе базальной мембраны.

    Клетки, обработанные коллагеназой 1 типа, формируют агрегаты, сохраняя при этом межклеточные связи, представленные белком ZO-1 и коннексином-43, что делает перспективным использование для культивирования планшетов, покрытых коллагеном 4 типа, ламинином 5 типа и перлеканом (рис. 1б).

    Популяция клеток эндотелия роговицы, выделенная ферментативно, характеризуется большей плотностью роста клеток в ростовой среде. В этой же популяции спустя 2 месяца культивирования количество плоских гексагональных клеток в поле зрения составляло 92,7±6,5%, тогда как в контрольных образцах недостоверно меньше 88±6% (рис. 1в).

    Разница между контрольной и опытной группами подтверждает необходимость стимуляции деления клеток при культивировании клеток эндотелия роговицы человека. Достижение лучшего результата, предположительно, связано со способностью коллагеназы ликвидировать митотический блок, возникающий вследствие контактного торможения (рис. 1а, в).

    Альтернативные методы стимуляции деления клеток, описанные в литературе, основывались на механическом разобщении клеток, что в присутствии факторов роста наряду со стимуляцией пролиферации стимулировало эпителиально-мезенхимальную транзицию. Данный факт делает затруднительным выделение клеток по вышеописанному методу ввиду широкого распространения использования фактора роста фибробластов β как митогена в ростовой среде. Помимо механического воздействия, исследователи использовали диспазу/трипсин/этилендиаминтетрауксусную кислоту, что, как оказалось при дальнейших исследованиях, может служить триггером для эпителиально-мезенхимальной транзиции и потери характерного гексагонального клеточного фенотипа [6, 12]. Эпителиально-мезенхимальный переход в культурах отмечался по достижению конфлюентности 70-80% в контроле и 90% в группе ферментативной дезагрегации. Как показали исследования, эпителиально-мезенхимальная транзиция инициируется пролиферацией как результат активации канонического сигнального пути Wnt в присутствии эндотелиального фактора роста и/или фактора роста фибробластов β. Данная транзиция принимает необратимый характер с прерыванием пролиферации, когда TGF-β1 выступает в роли триггера для канонического TGF-β сигнального пути с исходом в ядерную транслокацию pSmad2/3 и Zeb1/2 [11]. Так как исходом этих процессов является потеря нормального фенотипа клетками эндотелия роговицы человека, клеточно-инженерная стратегия для клеток данного вида должна быть направлена, в том числе, на избежание активации канонического Wnt-Smad2/3-Zeb1/2 сигнального пути. Перспективным способом для решения данной задачи видится добавление блокатора TGF-β сигнального пути в ростовую среду.

    Ферментативное выделение клеток эндотелия роговицы человека раствором коллагеназы 1 типа является более эффективным методом в сравнении с классической методикой пассивной миграции клеток с Десцеметовой мембраны.

    На эпителиально-мезенхимальный переход в культуре оказывает влияние способ выделения клеток эндотелия роговицы человека.

    Необходим поиск агентов биологического действия, способствующих снижению скорости и объема эпителиально-мезенхимального перехода.

    Методика культивирования клеток эндотелия роговицы человека с этапом ферментативной обработки может быть усовершенствована: целесообразно изучение влияния биопокрытия культуральной поверхности, а также выявление изменений при культивировании клеток в среде с добавлением блокатора сигнального пути Wnt с целью снижения проявления эпителиально-мезенхимальной транзиции.