Изучение in vitro антиангиогенной активности природных ингибиторов ангиогенеза: эндостатина, тумстатина и PEDF

Неоваскуляризация роговицы и ее осложнения являются причиной снижения зрительных функций при ряде глазных болезней, таких как пролиферативная диабетическая ретинопатия (ПДР), возрастная макулярная дегенерация (ВМД), офтальмогистоплазмоз, псевдогистоплазмозный синдром и осложненная миопия высокой степени. Рост глазных болезней, сопровождающихся неоваскуляризацией, и, как следствие, стойкой, а порой и необратимой потерей зрения, а также невысокая и непродолжительная эффективность VEGF-блокирующих методов лечения заставляют ученых всего мира искать новые способы и методы борьбы с патологическим ростом сосудов.

Накопленные фундаментальные знания о неоангиогенезе позволяют с высокой степенью уверенности говорить о том, что антиангиогенная терапия должна быть длительной либо действие препарата пролонгированным, а значит, он не должен вызывать лекарственной резистентности и системных побочных эффектов. Такими свойствами обладают природные ингибиторы ангиогенеза, постоянно вырабатываемые в организме. Среди 27 известных в настоящее время эндогенных ингибиторов ангиогенеза наиболее перспективными признаны эндостатин, тумстатин и фактор, выделенный из пигментного эпителия сетчатки — PEDF. Эти пептиды были взяты в разработку в рамках научного проекта, финансируемого РФФИ в 2008-2009 гг.

Цельнастоящей работы — изучение in vitro антиангиогенной активности эндостатина, тумстатина и PEDF.

Материал и методы

Блок антиангиогенных препаратов, состоящий из фрагментов природных ингибиторов ангиогенеза (эндостатина, тумстатина и PEDF), был создан с помощью биотехнологии генной инженерии (лаборатория биотехнологий ИБХ РАН, зав. лаб. — акад. Мирошников А.И.). Вначале осуществлены химико-ферментативный синтез и клонирование в Esherichia coli искусственных генов, кодирующих фрагмент тумстатина Tum8 (69-95), фрагмент PEDF (24-57) и фрагмент эндостатина (1-49). Сконструированы рекомбинантная плазмида, содержащая гибридный ген белка, в котором соединены аминокислотные последовательности фрагмента PEDF (24-57); плазмида, содержащая гибридный ген белка, в котором соединены аминокислотные последовательности фрагмента эндостатина (1-49), и плазмида, содержащая гибридный ген белка, в котором соединены аминокислотные последовательности фрагмента тумстатина (69-95). Созданы высокоэффективные штаммы-продуценты и наработаны опытные партии целевых пептидов. Биологическая активность полученных препаратов с целью изучения их механизмов и терапевтического потенциала изучалась на моделях in vitro.

Изучение биологической активности пептидов целевого назначения проводили с помощью классических методов, принятых при анализе активности про- и антиангиогенных препаратов.

Под антиангиогенной активностью понимали наличие у рекомбинантных пептидов:

· способности оказывать цитотоксический эффект на эндотелиальные клетки (ЭК), обеспечивающие жизнеспособность кровеносных сосудов;

· способности подавлять пролиферацию ЭК (1 этап ангиогенеза);

· способности подавлять миграцию ЭК (1 этап ангиогенеза);

· способности ингибировать образование трубочкоподобных структур (2 этап ангиогенеза);

· способности подавлять или останавливать образование анастомозов с близлежащими сосудами и препятствовать запуску кровотока (3 этап ангиогенеза);

· способности разрушать сформированные сосуды (аваскулогенная терапия).

Во избежание ложно-позитивных результатов использовали многоуровневую систему оценки на моделях in vitro. Исследования выполнялись двумя независимыми экспертами. Первичный скрининг активности пептидов на моделях in vitro проводили в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (докт. мед. наук Е.В. Степанова).

Для оценки цитотоксического эффекта использовали культуру эндотелиальных клеток (ЭК) мыши SVEC-4-10, трансформированной вирусом SV40 [2]. В качестве количественного показателя, отражающего глубину цитотоксического эффекта, использовали индекс процентного соотношения количества ЭК в опытном тестируемом образце к аналогичному показателю в контроле. Индекс выражался в процентах.

Антипролиферативная активность препаратов определялась модифицированным «митогенным» методом с использованием красителя Crystal violet на культуре ЭК мыши SVEC-4-10.

Миграционная активность ЭК оценивалась по способности препарата подавлять миграцию. Препараты тестировали с помощью модифицированного метода «раневой поверхности». Результаты оценивали как процент мигрирующих клеток в опыте по отношению к контролю (контроль: клетки в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2 нМ глутамина).

Способность препаратов ингибировать образование трубочкоподобных структур ЭК SVEC-4-10 анализировали в имплантате матригеля in vivo (на мышах-самках BDA) по методике Passaniti A. [1]. В качестве количественных показателей использовали длину трубочек и количество контактов между трубочками в имплантате матригеля.

Все пептиды (PEDF, тумстатин и эндостатин) проходили одинаковое тестирование в диапазоне концентраций от 20 до 0,1 нМ.

Полученные in vitro результаты сопоставляли.

Результаты и обсуждение

Было установлено, что препараты обладают неодинаковой цитостатической активностью. Наибольшим цитостатическим эффектом обладал PEDF. В присутствии PEDF в культуральной среде в концентрации 20 нМ выживаемость ЭК составляла 84±3%. Цитостатический эффект тумстатина был несколько ниже и составлял 90±1% при той же концентрации. Эндостатин не оказывал цитостатического эффекта на ЭК (табл. 1).

Антипролиферативная активность препаратов также различалась. Наибольшей активностью обладал тумстатин: пролиферация была подавлена на 65% в концентрации 20 нМ, ИК50 составила 10 нМ. Для сравнения: аналогичные показатели PEDF составили 53%, но достигались при более низкой концентрации препарата: ИК50 — 1 нМ. Таким образом, максимальное ингибирование пролиферации клеток наблюдалось при концентрации PEDF 1 нМ в среде (47% от контроля) (табл. 2).

На рис. 1-7 демонстрируются результаты теста образования трубочкоподобных структур в матригеле.

Заключение

В работе проводится сравнительный анализ антиангиогенной активности природных ингибиторов ангиогенеза. Известно, что большинство природных ингибиторов ангиогенеза представляют собой большие белковые молекулы, не обладающие антиангиогенными свойствами, например коллаген XVIII, из которого был получен первый ингибитор ангиогенеза — эндостатин. По своей сути природные ингибиторы представляют собой предшественников ингибиторов ангиогенеза и относятся к белкам экстраклеточного матрикса (ЭКМ), базальной мембраны сосудов и/или к белкам свертывания крови (плазминоген). Только небольшая часть природных ингибиторов является фрагментами белков, способных ингибировать ангиогенез, как, например, кальретикулин и/или продукт его расщепления — вазостатин. По своей структуре ингибиторы ангиогенеза в основном являются полипептидами, т.е. состоят из большого количества аминокислот. Чтобы иметь возможность проанализировать их эффекты и попытаться управлять ими, предложено использовать определенную последовательность фрагментов аминокислот. Установлено, что точки приложения различных фрагментов одного и того же антиангиогенного пептида, как, впрочем, и их биологические свойства, различаются. Поиск и идентификация фрагментов с антиангиогенной активностью — перспективное направление антиангиогенной терапии.

В настоящей статье авторы представили блок природных ингибиторов ангиогенеза, созданный с помощью современных биотехнологий рекомбинантной генно-конструктивной инженерии, состоящий из 3-х пептидов. Потенциально все 3 пептида обладали биологической активностью, которая могла проявляться на различных этапах ангиогенеза, а следовательно, все они могли быть пригодны в лечении неоваскулярных заболеваний глаз. Для тестирования применили международную схему тестирования про- и антиангиогенных препаратов. В работе представлены результаты первого этапа тестирования in vitro.

Мишенями природных ингибиторов ангиогенеза, как правило, являются эндотелиальные клетки. Основная их цель не убить ЭК, как структурную единицу сосудистой сети, а ингибировать ее пролиферацию и/или миграцию, и/или дифференцировку. Подавление именно этих функций ЭК прекращает рост новых сосудов. Все 3 тестируемых пептида обладали дозозависимой антиангиогенной активностью in vitro. Вместе с тем, их биологические эффекты проявлялись на разных этапах ангиогенеза. PEDF и тумстатин оказывали цитостатический эффект на культуре ЭК, блокировали их пролиферацию и образование трубочкоподобных структур. Эндостатин блокировал только образование трубочкоподобных структур и не влиял на выживаемость, пролиферацию и миграцию ЭК (табл. 3).

Теоретически тестируемые фрагменты могут оказаться полезными при офтальмопатологии. Однако для окончательного вывода необходимы экспериментальные исследования на животных. Учитывая, что в природе скорость ангиогенеза определяется балансом про- и антиангиогенных пептидов в органе-мишени (т.е. в тканях глаза), вторым этапом оценки терапевтического потенциала тестируемых ингибиторов должны быть экспериментальные исследования с использованием моделей заболеваний глаз, протекающих с неоангиогенезом.