Рис. 1 Этапы оперативного вмешательства: а) проведение десцеметорексиса диаметром 8,0 мм с использованием крючка Сински с обратным загибом; б) выкраивание трансплантата десцеметовой мембраны и эндотелия (диаметр 8,0 мм); в) разделение трансплантата на две части; г) введение трансплантата в переднюю камеру глаза в виде рулона через стеклянный инжектор с применением ирригационного метода; д) процесс расправления донорского трансплантата в передней камере глаза кролика при мидриазе; е) вид расправленного трансплантата ДМ с подвернутыми краями вследствие естественных эластических свойств ДМ экспериментального животного, фиксированный пузырьком воздуха, введенным в переднюю камеру
Fig. 1 Stages of surgery: a) performing descemetorhexis with a diameter of 8.0 mm using a Sinski hook with a reverse bend; б) grafting of the Descemet's membrane with endothelial cells (diameter 8.0 mm); в) separation of the transplant into two parts; г) graft implantation into the anterior chamber of the eye in the roll-form by a glass injector using the irrigation method; д) the process of expansion of the donor transplant in the anterior chamber of the rabbit eye with mydriasis; е) view of the expanded DM graft with tucked edges due to the natural elastic properties of the DM of the experimental animal, fixed by an air bubble introduced into the anterior chamber
Рис. 2. Биомикроскопическая картина глаз кроликов в динамике послеоперационного периода при прозрачном приживления трансплантата десцеметовой мембраны с эндотелием: а) 1 сутки п/о, отмечается тотальный отек стромы центральной зоны роговицы с утолщением её оптического среза и нарушением прозрачности; б) 7 сутки п/о, отмечается частичная резорбция отека на периферии и сохранение отека различной степени выраженности в центральной зоне; в) 1 мес. п/о, участок стромы роговицы в проекции трансплантата прозрачен, тотальное помутнение стромы вокруг трансплантата
Fig. 2. Biomicroscopic details of rabbit eyes in the dynamics of the postoperative period with transparent graft engraftment of the Descemet membrane with endothelium: a) 1 day postop, there is a total stromal edema of the central zone of the cornea with a corneal thickening and a decreaseof transparency; б) 7 days postop, there is a partial resorption of corneal edema on the periphery and preservation of edema of varying severity in the central zone; в) 1 month postop, the part of the corneal stroma in the projection of the graft is transparent, total clouding of the stroma around the graft
Известно, что при патологии эндотелиального слоя роговицы не всегда целесообразно проводить его замену, трансплантируя донорские клетки. В частности, при первичной эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса одним из актуальных направлений стала разработка и совершенствование операции изолированного десцеметорексиса (ИДР). Данная методика основана на способности собственных клеток эндотелия роговицы к миграции и заполнению ятрогенного дефекта [5, 7, 12]. Успех подобных операций во многом зависит от того, насколько быстро и эффективно произойдет трансфер клеток на «оголенные» участки стромы роговицы реципиента.
Несмотря на то что технология ТЭДМ уверенно вошла в клиническую практику, до настоящего момента нет достоверных исследований, дающих ответ на основной вопрос. А именно – чьи эндотелиальные клетки, донора или самого реципиента, заполняют участки стромы, лишенные десцеметовой мембраны? Изучение фундаментальной базы данных тканесберегающих методик эндотелиальной кератопластики позволит обеспечить повышение результативности вышеуказанных оперативных вмешательств и откроет новые направления по их совершенствованию. Следует также подчеркнуть, что в доступной нам литературе нет сообщений о выполнении операция ТЭДМ у экспериментальных животных, в частности, у кроликов.
Цель
Изучение особенностей операции и послеоперационного состояния глаз кроликов после трансплантации эндотелия и десцеметовой мембраны (ТЭДМ) с акцентом на определение вектора миграции трансплантированных эндотелиальных клеток роговицы.
Материал и методы
Рис. 3. Биомикроскопическая картина глаз кроликов в динамике послеоперационного периода в случае непрозрачного приживления трансплантата: а) 1 сутки после операции, отмечается тотальный отек всех слоев роговицы, трансплантат и его края не визуализируются; б) 7 сутки после операции, сохраняется тотальный отек роговицы, в отличие от глаз кроликов с прозрачным приживлением трансплантата, не отмечается резорбции отека по периферии; в) 1 мес. п/о, отек периферической части роговицы полностью резорбировался, в зоне десцеметорексиса сформировалось стойкое тотальное помутнение роговицы
Fig. 3. Biomicroscopic details of the eyes of rabbits in the dynamics of the postoperative period in the case of cloudy graft engraftment: a) 1 day postop, there is a total edema of all layers of the cornea, the graft and its edges are not visualized; б) 7 days postop, total corneal edema persists, in contrast the eyes of rabbits with transparent graft engraftment there is no resorption of edema along the periphery; в) 1 month postop, edema of the peripheral part of the cornea was completely resorbed, a persistent total corneal opacity formed in the area of descemetorhexis
Рис. 4. Биомикроскопическая картина глаз кроликов в динамике послеоперационного периода в случае полупрозрачного приживления трансплантата: а) 1 сутки после операции, отмечается тотальный отек всех слоев роговицы, трансплантат и его края не визуализируются; б) 7 сутки после операции, отмечается уменьшение отека роговицы; в) 1 мес. п/о, отек периферической части роговицы полностью резорбировался, в зоне десцеметорексиса сформировалось стойкое тотальное помутнение роговицы, в центральной оптической зоне наблюдается полупрозрачное приживление донорского трансплантата
Fig. 4. Biomicroscopic details of the eyes of rabbits in the dynamics of the postoperative period in the case of semitransparent graft engraftment: a) 1 day postop, there is a total edema of all layers of the cornea, the graft and its edges are not visualized; б) 7 days postop, there is a decrease in corneal edema; в) 1 month postop, edema of the peripheral part of the cornea was completely resorbed, a stable total clouding of the cornea was formed in the descemetorhexis zone, and a semitransparent engraftment of the donor transplant was observed in the central optical zone
Исследование проводили в соответствии с общепринятыми принципами гуманного обращения, определяющимися международными правилами по работе с лабораторными животными, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (принята 18.03.1986 г. и подтверждена 15.06.2006 г., г. Страсбург, Франция).
Техника операции: оперативное вмешательство проводили под масочным наркозом (Севоран). Оперировали только один (правый) глаз экспериментального животного. После обработки операционного поля и наложения двух пружинных векорасширителей (второй служил для ретракции «третьего века» кролика), конъюнктиву орошали раствором бетадина 5% с экспозицией 2 минуты. В верхней половине глазного яблока, в лимбальной зоне, отступя на 0,5 мм в сторону центра роговицы, формировали основной операционный доступ шириной 3,0 мм и два дополнительных (шириной 1,0 мм) напротив основного разреза и слева от него, на расстоянии 3-х часов. Со стороны эпителия наносили круговую метку роговицы диаметром 8,0 мм. После первых двух операций стала очевидна необходимость введения через парацентез в переднюю камеру растворов мезатона (1% – 0,2 мл), и гепарина (5000 Ед – 0,3 мл) для профилактики экссудативного выпота из радужки во влагу передней камеры. После этого влагу передней камеры замещали на раствор когезивного вискоэластика (1% раствор гиалуроната натрия в объеме 0,2–0,3 мл). Микрокрючком (по Сински с обратным профилем) с тупым кончиком проводили круговой десцеметорексис диаметром около 8,0 мм (рис. 1a) с последующим удалением десцеметовой мембраны пинцетом с тупыми браншами, после чего вискоэластик аспирировали и восстанавливали переднюю камеру сбалансированным солевым раствором. Корнеосклеральный диск реципиента размещали в держателе эндотелием кверху. Трепаном диаметром 8,0 мм наносили круговую метку с эндотелиальной стороны, на эндотелий наносили 2–3 капли 0,15% раствора трепанового синевого (Membrane Blue-Dual DORK, Голландия) для контрастирования. Десцеметову мембрану донора, расположенную к периферии от зоны трепанации, отсепаровывали с помощью роговичного пинцета с тупыми браншами (рис. 1б). Затем край ДМ захватывали пинцетом и подтягивали в сторону центра роговицы, отслаивая до половины, и укладывали в исходное положение. Аналогичным способом захватывали и отслаивали противоположный край десцеметовой мембраны. Поверхность эндотелия при этом неоднократно капельно орошали консервационной средой из шприца объемом 2,0 мл без канюли. Полученный трансплантат диаметром 8,0 мм разрезали на две равные половины с помощью микролезвия (рис. 1в). На каждой половине десцеметовой мембраны проводили краевую ориентирную насечку в виде неравнобедренного треугольника. Сформированные трансплантаты помещали в раствор для хранения роговицы (ТУ 9398-013-29039336-2008, производитель – ООО «НЭП «Микрохирургия глаза», Москва). Введение трансплантата в переднюю камеру глаза кролика (самки) проводили с использованием прямой стеклянной пипетки, соединенной трубкой со шприцом объемом 5,0 мл, содержащим физиологический раствор (рис. 1г). Далее трансплантат расправляли и центрировали поглаживающими движениями по наружной поверхности роговицы канюлей 25G и шпателем (рис. 1д). После расправления и центрации трансплантат фиксировали при помощи пузыря воздуха, введенного в переднюю камеру (рис. 1е).
Таким образом, по завершении операции вокруг трансплантированной ДМ донора была сформирована «оголенная» зона стромы роговицы кролика-реципиента (самки) шириной около 2,0–2,5 мм, не прикрытая ни собственной, ни донорской десцеметовой мембраной. Указанная зона роговицы реципиента являлась в последующем предметом для изучения на наличие эндотелиальных клеток реципиента (кролика-самки) или донора (кролика-самца) с целью определения направленности эндотелиального трансфера.
В послеоперационном периоде всем кроликам проводили антибактериальную и противовоспалительную терапию (инстилляции 0,5% раствора левофлоксацина и 0,1% раствора дексаметазона 3–4 раза в день). Осмотр животных и фоторегистрацию послеоперационных результатов проводили на сроках 1 день, 7 дней и 1 мес. Лабораторных животных выводили из эксперимента через 1 мес. после операции.
Исследования по установлению половой принадлежности эндотелиальных клеток трансплантированной десцеметовой мембраны и участка стромы роговицы, оголенного в процессе хирургического вмешательства, энуклеированного глаза кролика проводили на основании полового диморфизма клеток на 2-х глазах. Исследование выполняли сразу после забоя экспериментальных животных на сроке 1 мес. после операции. Для анализа были использованы изолированные эндотелиальные клетки глаза кролика-реципиента из двух зон заднего слоя роговицы: первая – центральная область трансплантата диаметром 3 мм, вторая – периферическая зона на расстоянии 6–8 мм от центра. Суспензию эндотелиальных клеток зафиксировали на предметном стекле, после чего проводили окрашивание азур-эозином с последующей световой микроскопией, а также раствором акрихина и дальнейшей визуализацией люминесцентной микроскопией. В клетках периферической области проанализированы ядра, находящиеся в интерфазе, на предмет наличия хроматиновых телец – телец Барра.
Пять других энуклеированных глаз кроликов были помещены в 10% формалин и находились в нем в течение четырех месяцев. Для дальнейшего исследования глаза были извлечены из консервационного раствора и промыты дистиллированной водой. Из глаз вырезаны фрагменты роговицы с десцеметовой мембраной и монослоем эндотелиальных клеток из зоны операции. Вырезанный материал инкубировали при +8о С в течение 72 часов в Tris-глициновом буфере со сменой буфера два раза в сутки. Выделение ДНК из фрагмента ткани проводили по стандартной методике: обработка в течение 16 часов при 56° C протеиназой К в присутствии дитиотреитола, фенол-хлороформная экстракция, концентрирование переосаждением этиловым спиртом. Полученную ДНК использовали в полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации sex-determining региона Y-хромосомы (gSRY) у кролика с использованием праймеров SRYfor: CAGGAACGGGTCAAGCGAC и SRYrev: AGATCAGTACGCCTTCTTG. Результаты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. Учет результатов проводили в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм. Размеры молекул анализируемых образцов ДНК определяли путем сопоставления их электрофоретической подвижности в геле с подвижностью маркеров – фрагментов ДНК известной молекулярной массы (100+ bp DNA Ladder, Евроген).
Результаты
Через 1 сутки после операции у всех кроликов наблюдали умеренный блефароспазм, смешанную инъекцию конъюнктивы и выраженный отек роговицы. Во всех случаях при биомикроскопии с помощью щелевой лампы трансплантаты были расположены правильно и прилежали к задней поверхности роговицы реципиента. Пузырь воздуха занимал примерно ⅓ от объёма передней камеры. На 7 сутки после операции воздух полностью рассосался, полной резорбции отека удалось достичь в 3-х случаях из 10. Несмотря на полную резорбцию отека вокруг трансплантата наблюдали участки помутнения, корреспондирующие с зонами оголенной в результате десцеметорексиса стромы роговицы. В 4 случаях наблюдали отёк роговицы, сопровождавшийся развитием её помутнения, корреспондирующим с зоной десцеметорексиса.
В сроки от 7 до 30 суток после операции из исследования были исключены 2 кролика (2 глаза) в связи со смертью лабораторных животных от естественных причин.
Через 1 мес. после операции у 3-х кроликов (3 глаза) была достигнута полная резорбция отека с четко сформировавшимся помутнением, ограничивающим трансплантат от оголенной стромы (рис. 2). У одного кролика (1 глаз), прооперированного без введения гепарина в переднюю камеру, наблюдали полупрозрачное приживление трансплантата, что, по нашему мнению, связанно с активным выбросом фибрина в переднюю камеру и последующим образованием множества фибриновых пленок, которые препятствовали полному прилеганию трансплантата десцеметовой мембраны к задней поверхности стромы кролика-реципиента (рис. 4).
У 4 кроликов (4 глаза) сформировалось центральное помутнение роговицы, соответствующее зоне десцеметорексиса (рис. 3).
При цитологическом исследовании в клетках эндотелия исследуемых роговиц (2 глаза) были обнаружены овальные глыбки Х-хроматина с гомогенным окрашиванием, прилежащие к внутренней поверхности ядерной оболочки. Вокруг глыбок чётко выявлялась светлая зона, наличие которой позволяет дифференцировать Х-хроматин от других гетерохроматиновых образованиях ядра. В 80% интерфазных ядер эндотелиальных клеток периферической области обнаружили Х-хроматин. В эндотелиальных клетках, полученных из центральной зоны, образования Х-хроматина в интерфазных ядрах составили 8%. Отсутствие спирализованной гиперпикнотической Х хромосомы в интерфазном ядре части эндотелиальных клеток периферической зоны может свидетельствовать о миграции клеток трансплантата на оголенные участки стромы. В то же время наличие Х-хроматина в центральной области предположительно является причиной замещения трансплантата клетками реципиента.
Молекулярно-генетический анализ (6 глаз) показал, что при амплификации с помощью праймеров SRYfor и SRYrev к gSRY, локализованному на Y-хромосоме в регионе, определяющем половую принадлежность, положительные отклики не регистрировались (рис. 5) ни для одной из исследуемых областей роговицы с десцеметовой мембраной и монослоем эндотелиальных клеток.
Обсуждение
Несмотря на стремительную популяризацию методики трансплантации эндотелия и десцеметовой мембраны (ТЭДМ), исследований по определению вектора и источника трансфера эндотелиальных клеток к настоящему моменту крайне мало. Имеющиеся работы основаны на клиническом материале, экспериментальные исследования в доступной нам литературе не встречены.
Группа исследователей во главе с Lavy I. в 2016 г. поставили целью оценку выживаемости донорских эндотелиальных клеток при ТЭДМ в глазу реципиента в отдаленном послеоперационном периоде: они провели разделение доноров и реципиентов по половой принадлежности, а затем, в отдаленные сроки после операции (в среднем 2,6 года) in vivo путем определения флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) в глазу реципиента определяли половую принадлежность эндотелиальных клеток трансплантата и на участках с оставшимися клетками реципиента. В результате авторы заключили, что имеет место преимущественно замещение клетками реципиента клеток донорского трансплантата [9].
Lagali N. с соавт. (2010) также использовали принцип разделения реципиента и донора по половой принадлежности с дальнейшим проведением FISH-исследования. Однако по результатам данного исследования они не получили достоверных данных, позволяющих судить о направленности трансфера эндотелиальных клеток [13].
Результаты, полученные Hos D. [8], также свидетельствуют в пользу того, что источником мигрирующих эндотелиальных клеток является трансплантат. Автор описывает два случая трансплантации десцеметовой мембраны пациентам с эндотелиальной патологией, у которых в послеоперационном периоде развилась аутоиммунная реакция с образованием преципитатов на трансплантате и на окружающем его участке стромы, которая была заселена в результате трансфера эндотелиальных клеток. Однако при этом участок собственной десцеметовой мембраны, оставшейся на периферии с монослоем собственных эндотелиальных клеток пациента, не был вовлечен в воспалительную реакцию.
В противовес вышеуказанным сообщениям, представляющим донорский трансплантат как источник трансфера эндотелиальных клеток, имеют место множественные исследования ауто-миграции собственных эндотелиальных клеток и уменьшения отека роговицы после изолированного десцеметорексиса [4, 5, 10]. Эти данные корреспондируют с полученными нами результатами о направленности эндотелиального трансфера из собственной роговицы пациента.
Используя цитологический метод исследования, нам не удалось четко доказать пути распространения клеток трансплантата или клеток донора –самцов при ТЭДМ. В связи с тем, что в ядрах клеток самцов могут встречаться хроматиновые образования, имитирующие по форме и локализации Х-хроматин, а также с тем, что не во всех ядрах клеток самок выявляется данное образование, нами дополнительно проведено установление половой принадлежности интересующих клеток с помощью молекулярно-генетического исследования. В результате в биопсийных пробах периферической области роговиц после ТЭДМ не обнаружили клетки, несущие Y-хромосому в зону десцеметорексиса.
Таким образом, по результатам проведенного исследования можно предположить, что восстановление разрушенного слоя эндотелиальных клеток происходит в направлении от периферии к центру, т.е. «оголенная» зона стромы роговицы реципиента кролика-самки заполняется мигрирующими собственными эндотелиальными клетками с периферии роговицы, а не клетками донорского трансплантата кролика-самца.
Установление факта миграции собственных клеток реципиента в зону дефекта ДМ может свидетельствовать в пользу обоснованности применения тканесберегающих методик эндотелиальной кератопластики, при которых размер трансплантата меньше размера дефекта эндотелиального монослоя. Следует при этом подчеркнуть, что формирование циркулярного помутнения роговицы на глазах с прозрачной центральной зоной, по-видимому, свидетельствует о недостаточном регенераторном потенциале периферических клеток либо о слишком большом ятрогенном дефекте ткани. В этой связи, нам представляется перспективным определение оптимального соотношения пересаживаемой ткани и зоны задней поверхности роговицы, которая в результате операции остаётся не прикрытой трансплантатом ТЭДМ, что требует дальнейших исследований в данном направлении.
Заключение
В результате проведенного исследования впервые в мире продемонстрирована техническая возможность выполнения частичной ТЭДМ в эксперименте на глазах кроликов, обеспечивающая полное восстановление прозрачности центральной зоны роговицы в 37,5% (3 из 8 глаз) случаев. Особенностью регенераторного ответа роговиц экспериментальных животных следует считать формирование помутнения стромы, окружающей прозрачную центральную зону роговицы. Невозможность идентифицировать эндотелиальные клетки донора (кролика-самца) на средней периферии роговицы реципиента (кролика-самки) позволяет сделать обоснованное предположение об отсутствии их миграции в зону дефекта. Согласно полученным данным, при прозрачном приживлении трансплантата ДМ, содержащего эндотелий роговицы, восстановление ятрогенно удаленного слоя эндотелиальных клеток вместе с десцеметовой мембраной происходит в направлении от периферии к центру.
