Рис. 1. Экспрессия Caspasa 8 (AF 488); Цитохром С (AF 594) в роговицах с образцом 1 (а); с образцом 2 (б); с образцом 3 (в); контроль (г); ув. 600 Fig. 1. Expression of Caspasa 8 (AF488); Cytochrome C (AF 594) in the cornea with sample 1 (а); with sample 2 (б); with sample 3 (в); control (г); x600
Рис. 2. Изменение экспрессии Caspasa 8 в роговицах с изучаемыми образцами в сравнении с контрольной роговицей до и после культивирования Fig. 2. Changes in the expression of Caspasa 8 in the corneas with the studied samples in comparison with the control cornea before and after cultivation
Иридохрусталиковая диафрагма (ИХД) необходима человеку для нормального функционирования зрительной системы, поскольку она уменьшает сферические и хроматические аберрации, увеличивает глубину резкости, предохраняет сетчатку от излишнего попадания света. Необратимое расширение зрачка ведет к монокулярной диплопии, выраженной фотофобии и является серьезным косметическим недостатком [4, 5].
Развитие данного вопроса и существующие подходы к решению этой проблемы хирургическим способом описаны отечественными и зарубежными авторами: от пупилло- и иридопластики, применения аутотканей или аллотрансплантатов для замещения дефектов радужной оболочки в комплексе с одновременным использованием некоторых моделей интраокулярных линз (ИОЛ), до создания искусственной радужки и ИХД [6, 7, 8]. Существующие методы коррекции дефектов радужки наряду с их преимуществами обладают рядом индивидуальных недостатков и не всегда эффективны.
Зрительная реабилитация пациентов с дефектами радужки является актуальной, так как большинство пациентов – активные трудоспособные люди, страдающие от низкой остроты зрения в связи с засветами и аберрациями, что снижает качество жизни. Интраокулярная хирургия с имплантацией искусственной радужки проводится часто, но не является оптимальной в лечении некоторых категорий пациентов (например, после иридоциклэктомии по поводу новообразования) из-за возможной травматичности и способа фиксации. Перспективным представляется интрастромальное введение красящего вещества в проекции колобомы радужки для создания диафрагмирующего эффекта. В современной офтальмохирургии кератопигментация успешно проводится зарубежными врачами, однако следует отметить, что на территории Российской Федерации не существует зарегистрированных и разрешенных к применению в клинической практике внутрироговичных окрашенных имплантатов для коррекции дефектов радужки. В связи с этим актуальной является разработка интракорнеального окрашенного имплантата для решения функциональных и косметических аспектов проблемы аниридии и изучение его биосовместимости с тканями глаза.
Цель
Оценка влияния разработанных внутрироговичных гелевых окрашенных имплантатов для кератопигментации на основе различных материалов на донорскую роговицу человека в процессе органотипического культивирования и визуализация структур роговицы в присутствии образцов с помощью электронной микроскопии.
Материал и методы
Рис. 3. Изменение экспрессии Цитохрома С в роговицах с изучаемыми образцами в сравнении с контрольной роговицей до и после культивирования Fig. 3. Changes in the expression of Cytochrome C in the corneas with the studied samples in comparison with the control cornea before and after cultivation
Рис. 4. Экспрессия Caspasa 3/7 (AF 488); ВАХ (AF 594) в роговицах с образцом 1(а); с образцом 2 (б); с образцом 3 (в); контроль (г); ув. 600 Fig. 4. Expression of Caspasa 3/7 (AF488); BAX (AF 594) in the cornea with sample 1 (а); with sample 2 (б); with sample 3 (в); control (г); x600
1. Натрия гиалуронат в концентрации 1,0%, молекулярная масса 4000 кДа.
2. «Сферооко» – протектор эпителия роговицы гелевый, созданный на основе гидролизата коллагена.
3. Гидроксипропилметилцеллюлоза в концентрации 2%, молекулярная масса от 80 до 100 кДа.
В качестве красителей для введения в состав образцов были выбраны:
1. Нерастворимый органический пигмент коричневого цвета Ciba CHROMOPHTAL BROWN 5R (Item 0149358V7, Lot 001580H0), применяемый для окрашивания ИХД, который добавляли к основе из ГПМЦ и гиалуроната натрия.
2. Краситель зеленого цвета, успешно зарекомендовавший себя в дерматокосметологии, созданный на основе оксидов железа, использование которых разрешено в косметической промышленности в качестве красителей для микропигментации кожи лица и тела (производитель Goochie, КНР). Добавляли к основе из «Сферооко». Состав красителя: неорганический тонер: 28%, натуральный эмульгатор (пропиленгликоль): 15%, раствор желатина: 8%, загуститель: 12%, дистиллированная вода: 45%.
Рис. 5. Фрагмент роговицы с интрастромальным тоннелем - контрольный образец; ув. 100 (а); ув. 500 (б) Fig. 5. Fragment of a cornea with intrastromal tunnel - control sample; x100 (а); x500 (б)
Рис. 6. Фрагмент роговицы с образцом № 1; ув. 100 (а); ув. 500 (б) Fig. 6. Fragment of a cornea with sample №1; x100 (а); x500 (б)
- образец №1 – Натрия гиалуронат + CHROMOPHTAL;
- образец №2 – «Сферооко» + краситель с неорганическим тонером
- образец №3 – ГПМЦ + CHROMOPHTAL
Для оценки влияния трех разработанных внутрироговичных гелевых окрашенных имплантатов на стромальные клетки было взято 12 роговиц, полученных из Глазного тканевого банка МНТК «Микрохирургии глаза», не пригодных для трансплантации. Роговицы имели следующие характеристики: средний возраст донора 58 ± 16 лет, 8 мужчин и 4 женщины, среднее время от момента смерти до ввода в эксперимент составило 18 ± 5 часов. Во всех роговицах был сформирован интрастромальный тоннель механическим способом. Опытные группы содержали роговицы с введенными в них образцами (n=3 для каждого образца), контрольную группу составили роговицы без введенного имплантата (n=3).
Культивирование роговиц в ходе исследования проводилось в инкубаторе (NuAire, США) при стандартных условиях: t +37 оС, 5% CО2; в полной питательной среде: DMEM/F12 (Sigma, США) c добавлением 2% эмбриональной бычьей сыворотки (Thermo Fisher, США), 1% раствора антибиотиков (Thermo Fisher, США) и 1% раствора GlutaMAX (Thermo Fisher, США). Визуальный контроль осуществлялся при помощи инвертированного светового фазово-контрастного микроскопа Olympus IX- 81 (Olympus, Япония). Спустя 7 суток культивирования роговицы извлекали из питательной среды и промывали трехкратно фосфатно-солевым буфером (ПанЭко, Россия) для исследования на апоптоз.
Для определения токсичности изучаемых образцов определяли апоптоз стромальных клеток роговицы – кератоцитов в криостатных срезах роговицы. Для этого роговицу заливали гелем для заморозки (Thermo Fisher, США) с последующей заморозкой в течение 20 мин при -30 oС. Роговицу фиксировали горизонтально, срез проводился вертикально под углом 90о. Полученные срезы толщиной 5 мкм приклеивали к полилизиновым стеклам (Thermo Fisher, США).
Для исследования апоптоза использовали метод иммуногистохимии. Срезы обрабатывали раствором Тритон X-100 (Thermo Fisher, США) в течение 10 минут. Для изучения каспазного пути апоптоза использовали первичные антитела к Caspasa 8 (Abcam, Великобритания), Caspasa 3/7 (Abcam, Великобритания), а для изучения митохондриального пути апоптоза – BAX (Abcam, Великобритания), Cyt C (Abcam, Великобритания), культивирование с антителами производили в течение 60 мин при комнатной температуре. Производили трехкратное промывание срезов раствором фосфатно-солевого буфера (ПанЭко, Россия). Для детекции первичных антител использовали флуоресцентные краситель Alexa Fluor 488 (Ex. 495; Em. 519) (Abcam, Великобритания) и Alexa Fluor 594 (Ex. 590; Em. 617) (Abcam, Великобритания), культивирование производили в течение 60 мин, при комнатной температуре. Контрастирование клеточных ядер проводили красителем Hoechst 33342 (Abcam, Великобритания). Для детекции антител использовали конфокальный лазерно-сканирующий микроскоп Olympus Fi-10i (Olympus, Япония).
Полученные снимки анализировали, используя программное обеспечение «Cell Profiler», которое позволяет выделять необходимые для анализа клеточные компоненты, а именно ядро, цитоплазму или клетку (ядро + цитоплазма), и рассчитать интенсивность свечения каждой клетки, используя встроенные инструменты программного обеспечения.
Для визуализации структур роговицы в присутствии образцов использовали метод сканирующей электронной микроскопии. В качестве фиксатора для роговиц использовался 10% раствор формалина (ДиаЭм, Россия). Для проведения оптимальной дегидратации применялся раствор ацетона (ДиаЭм, Россия) в восходящих концентрациях: 10, 20, 30, 50, 70, 90, 100 х3 % по 30 мин в каждом с последующей вакуумной сушкой в критической точке. После сушки образцы монтировались на алюминиевом столике с помощью карбонового клея, напылялись золотом с толщиной слоя 5 нм для обеспечения электронно-проходящего слоя на поверхности образца. Далее образцы помещались в камеру сканирующего электронного микроскопа (Jeol, Япония) и исследовались в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 5 кВ.
Рис. 7. Фрагмент роговицы с образцом №2; ув. 100 (а); ув. 500 (б) Fig. 7. Fragment of a cornea with sample №2; x100 (а); x500 (б)
Рис. 8. Фрагмент роговицы с образцом № 3; ув. 100 (а); ув. 500 (б) Fig. 8. Fragment of a cornea with sample №3; x100 (а); x500 (б)
Результаты
При исследовании на апоптоз были изучены инициаторные маркеры апоптоза каспазного пути – Каспаза 8 и митохондриального пути – BAX и Цитохром С. Данные белки относятся к начальным этапам апоптоза, когда процесс программируемой клеточной гибели носит обратимый характер. Для определения эффекторных белков апоптоза (необратимый этап) обоих путей были исследованы Caspasa 3/7.
Установлено, что экспрессия Цитохрома С и Caspasa 8 в роговицах с образцами №1 и 3 была сопоставимой и статистически выше (р<0,05) по сравнению с контрольной группой. При этом статистически значимых различий в роговицах с образцом №2 и контрольной группой выявлено не было (p>0,05), значения p указаны на рисунках 2 и 3 (рис. 1–3, табл. 1–2).
В исследуемых образцах экспрессия инициаторного маркера митохондриального пути апоптоза BAX отсутствовала. Изучение экспрессии эффекторных маркеров Caspasa 3/7 показало отсутствие статистически значимых различий (рис. 4, табл. 1–2). Данные представлены в формате M±σ, где М – среднее арифметическое, σ – стандартное отклонение.
В исследуемых образцах экспрессия инициаторного маркера митохондриального пути апоптоза BAX отсутствовала. Изучение экспрессии эффекторных маркеров Caspasa 3/7 показало отсутствие статистически значимых различий (рис. 4, табл. 1–2).
При сканирующем электронно-микроскопическом исследовании роговиц контрольной группы были выявлены незначительные различия в толщине стромальных коллагеновых волокон до и после культивирования, сформированный тоннель был слабо выражен (рис. 5).
Исследование образца №1 показало, что после культивирования детектируется частичное вымывание красителя и образование волокнистой структуры в профиле сформированного тоннеля (рис. 6).
В роговицах с образцом №2 изменение толщины волокон не отмечалось, краситель полностью заполнял весь объём сформированного канала, новообразованных волокон обнаружено не было (рис. 7).
В исследуемых роговицах с образцом окрашенного имплантата №3 было выявлено уменьшение толщины коллагеновых волокон, также отмечалось значительное вымывание красителя из интрастромального тоннеля, новообразованных волокон не отмечалось (рис. 8).
Обсуждение
Таблица 1 Экспрессия инициаторных маркеров апоптоза до культивирования Table 1 Expression of initiator markers of apoptosis before cultivation
Таблица 2 Экспрессия инициаторных маркеров апоптоза до культивирования Table 2 Expression of initiator markers of apoptosis after cultivation
По данным литературы, при использовании жестких интракорнеальных имплантатов отмечалось несоответствие профиля имплантата профилю роговицы и прорезывание периферического края диафрагмы через роговичный разрез наружу через несколько месяцев после операции [9, 10].
Сложность имплантации внутрикапсульных колец с окрашенными «плавниками» модели Morcher 50C заключается в том, что 2 капсульных кольца с черными «плавниками» должны быть введены в капсульный мешок и соединены там в единую диафрагму, что сложно в связи с хрупкостью модели и возможной необходимостью последующего дополнительного введения в капсульный мешок интраокулярной линзы. Даже если соединение колец во время операции достигнуто, в послеоперационном периоде возможно их рассоединение в глазу с аниридией в связи с контрактурой капсульного мешка [11]. Имплантация искусственной радужки подразумевает интраокулярное вмешательство, что не является методом выбора у пациентов с колобомами радужки после удаления ее новообразований ввиду потенциального контакта с ранее оперированной зоной. В случае непереносимости контактной коррекции наиболее безопасным способом представляется кератопигментация, исключающая манипуляции с проникновением в переднюю и заднюю камеры глаза.
В современной офтальмологии при проведении кератопигментации для зрительной реабилитации пациентов с обширными дефектами радужной оболочки используются разные виды химических веществ. Чаще всего встречаются пигменты на органической и неорганической основе (оксиды металлов) [12, 13].
По данным литературы, зарубежные офтальмологи использовали при проведении кератопигментации как органический, так и неорганический пигмент. При использовании органического пигмента в клинической практике у пациентов осложнений отмечено не было, но через 3–6 месяцев отмечалось побледнение и частичное вымывание пигмента [14]. При использовании неорганического пигмента (в составе 50% оксида железа) на экспериментальных животных было отмечено 2 случая воспаления и минимального отека, который разрешился в течение 2 недель после операции. Ни одного случая изменения цвета пигмента обнаружено не было [13].
В ходе проведения исследования нами было показано, что внутрироговичный гелевый окрашенный имплантат на основе гидролизата коллагена и красителя с неорганическим тонером (28% тонера в составе) вызывает слабую экспрессию инициаторных белков апоптоза Caspasa 8 и Цитохром С, отмечено отсутствие экспрессии ВАХ и эффекторных белков Caspasa 3/7. Выявлено, что образцы №1 и №3, имеющие в составе органический краситель, подвергаются частичному растворению и вымыванию из интрастромального тоннеля. Образец №2 на основе гидролизата коллагена и имеющий в составе неорганический краситель имеет плотную структуру, сохраняется в роговичном тоннеле на всем протяжении культивирования, как минимум 7 суток, что отражено с помощью электронно-сканирующей микроскопии.
Таким образом, основными требованиями, предъявляемыми к результатам кератопигментации, являются: стабильность расположения гелевого имплантата внутри роговичного тоннеля, его биосовместимость с тканями роговицы, и, как следствие, безопасность использования, стойкая фиксация цвета с выполнением экранирующей функции для оптимального зрительного эффекта у пациента. Предложенный гелевый окрашенный имплантат на основе гидролизата коллагена можно считать компактным и нетоксичным.
Заключение
1. По итогам органного культивирования в течение 7 дней наилучшие результаты показал внутрироговичный гелевый окрашенный имплантат на основе гидролизата коллагена и неорганического тонера (образец №2).
2. Внутрироговичный гелевый окрашенный имплантат на основе гидролизата коллагена имеет более компактную и плотную структуру, нежели сопутствующие экспериментальные образцы. Учитывая полученные данные, перспективным представляется дальнейшее его исследование в эксперименте in vivo (на экспериментальных животных).
Вклад авторов в работу:
С.Б. Измайлова: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
С.А. Борзенок: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
О.Ю. Комарова: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.
Д.С. Островский: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.
Author’s contribution:
S.B. Izmailova: substantial contribution to concept and design of the work, editing, final approval of the version to be published.
S.A. Borzenok: substantial contribution to concept and design of the work, editing, final approval of the version to be published.
O.Yu. Komarova: substantial contributions to the concept and design of the work, acquisition, analysis and processing, statistical processing of data, writing of the text.
D.S. Ostrovkiy: a significant contribution to the concept and design of the work, acquisition, analysis and processing, statistical processing of data, writing of the text.
Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.
Авторство: Все авторы подтверждают, что они соответствуют действующим критериям авторства ICMJE.
Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.
Конфликт интересов: Отсутствует.
ORCID ID: Комарова О.Ю. 0000-0001-5286-7552
Funding: The authors have not declared a specific grant for this research from any funding agency in the public, commercial or not-for-profit sectors.
Authorship: All authors confirm that they meet the current ICMJE authorship criteria.
Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.
Conflict of interest: Тhere is no conflict of interest.
ORCID ID: Komarova O.Yu. 0000-0001-5286-7552
