Клинико-морфологические особенности клеточного состава идиопатических эпиретинальных мембран у пациентов с различной остротой зрения

     Эпиретинальная мембрана (ЭРМ) – это медленно прогрессирующая приобретенная патология органа зрения, которая сопровождается образованием тонкой полупрозрачной фиброзно-клеточной пленки в макулярной области. ЭРМ обладает способностью к сокращению и может приводить к искривлению поверхности витреомакулярного интерфейса, что в свою очередь обусловливает снижение остроты зрения и развитие метаморфопсий [3, 5, 17].

    Впервые ЭРМ была описана Ivanoff A. в 1865 г. [9]. Макулярные ЭРМ могут быть как идиопатическими, развивающимися без сопутствующих глазных заболеваний, так и вторичными по отношению к другой патологии органа зрения. Чаще всего идиопатические макулярные эпиретинальные мембраны возникают после 50 лет, одинаково часто у мужчин и женщин. Приблизительно у 20% пациентов обнаруживают двусторонние макулярные эпиретинальные мембраны, как правило, различной степени тяжести. У большинства пациентов при этом выявляют заднюю отслойку стекловидного тела.

    В настоящее время не существует единой точки зрения, объясняющей причины и патогенетические особенности развития ЭРМ. Согласно данным литературы важную роль в процессе её формирования играют возраст и задняя отслойка стекловидного тела. Так, согласно одной из теорий, в случае частичной отслойки СТ при более прочной фиксации кортикальных слоев к макуле, тракционное воздействие СТ на сетчатку вызывает формирование дефектов ВПМ [8, 15]. Через данные дефекты происходит выход глиальных и других типов клеток на поверхность сетчатки с последующей пролиферацией, что является защитным механизмом с целью предотвращения апоптоза фоторецепторов [13, 16]. При хирургическом пилинге данного типа ЭРМ, согласно данным ряда авторов, происходит одновременное удаление ВПМ или ее фрагментов ввиду плотной адгезии компонентов ЭРМ – коллагена II типа и клеточных элементов к ВПМ [10].

    Согласно другой теории, при формировании задней отслойки СТ может происходить расслоение кортикальных слоев, при котором часть их остается на поверхности сетчатки в макулярной области и является субстратом для развития пролиферации глиальных клеток и гиалоцитов [11, 16]. В пользу данной теории говорит исследование отечественных авторов, изучающих особенности структурно-функциональной организации СТ в области ВРИ. Так в ходе хромовитрэктомии регматогенной отслойки сетчатки, эпиретинальных мембран и макулярных разрывов с помощью ультрадисперсной контрастирующей суспензии «Витреоконтраст» было обнаружено, что при образовании дефектов в кортикальных слоях структура СТ изменяется, и формируется грыжа СТ. В случае плотной фиксации к сетчатке кортикальных слоев при их сокращении происходит расслоение СТ, при этом слой волокон СТ может оставаться на поверхности сетчатки. Отмечено, что при пилинге возможно удаление нескольких слоев ЭРМ и ВПМ [2]. Таким образом, исходя из современного представления о возможных механизмах формирования ЭРМ, до настоящего времени не существует единой теории, объясняющей закономерности развития данного процесса.

    Идиопатические ЭРМ состоят из 2 важных компонентов: клеточных элементов и белков внеклеточного матрикса. В состав клеточного компонента входят глиальные клетки (клетки Мюллера, астроциты и микроглия), гиалоциты, макрофаги, клетки пигментного эпителия сетчатки, фибробласты и миофибробласты. Гистологические исследования образцов ЭРМ, удаленных во время хирургического лечения, подтвердили наличие различных типов клеток и компонентов экстрацелюллярного матрикса.

    Независимо от происхождения исходных клеточных компонентов, ключевым моментом в процессе формирования и прогрессирования ЭРМ является их трансдифференциация в миофибробластоподобные клетки. Для данного типа клеток характерно выраженное продуцирование трансформирующего фактора роста и коллагена, что способствует сокращению (сморщиванию) мембраны.

     До настоящего времени нет единого представления об источнике клеток-предшественников миофибробластоподобных клеток. Возможными их источниками являются резидентные фибробласты, гладкомышечные клетки, эпителиальные, эндотелиальные, мононуклеарные клетки, а также перициты сосудов микроциркуляторного русла [1, 6]. Остаются невыясненным, однако, причина и механизмы миграции этих столь различных клеток на поверхность сетчатки. Известно, что индуцируют активацию и пролиферацию миофибробластов цитокины (IL1, IL4, IL6, IL8) и факторы роста (TGF-a, TGF-β1, EGF). При этом наиболее выраженным активирующим эффектом обладает трансформирующий фактор роста TGF-β1 [4, 6, 7]. Он обеспечивает выделение маркера дифференцировки гладкой мускулатуры – α-SM актина. Повышенная экспрессия α-SM актина, в свою очередь, непосредственно коррелирует с усилением генерации сил миофибробластами, что приводит к сокращению мембраны и натяжению сетчатки. Данный процесс также зависит от ремоделирования коллагена, который происходит в результате реорганизации внеклеточного матрикса [12].

    Следует отметить, что огромное число исследований посвящено изучению клеточного состава ЭРМ. Согласно результатам отечественных и зарубежных авторов данные о соотношении и преобладании тех или иных типов клеток в мембранах разнятся, в результате чего до сих пор не существует единого мнения относительно качественного состава мембран. Кроме того, обнаружение с помощью иммуногистохимии и электронной микроскопии новых клеточных элементов в составе эпиретинальной пролиферации подтверждает возможность вторичной дифференцировки ряда клеток в процессе формирования мембраны. Поэтому вопрос идентификации морфологических элементов ЭРМ на различных этапах ее формирования остается актуальным.

    Цель

    Провести клинико-морфологическое исследование качественного состава эпиретинальных мембран у пациентов с различной степенью выраженности патологического процесса.

    Материал и методы

    Для данного исследования были отобраны 60 пациентов (60) глаз с диагнозом «Идиопатический эпиретинальный фиброз». Критериями оценки степени выраженности патологического процесса явились жалобы на снижение остроты зрения и наличие метаморфопсий, давность течения процесса (до 6 мес., от 6 мес. до 1 года, более года), данные оптической когерентной томографии (ОКТ), чувствительность сетчатки в макулярной зоне по данным микропериметрии.

    Все пациенты были разделены на 3 равные группы по 20 пациентов (20 глаз) в каждой в зависимости от исходной максимально корригированной остроты зрения (МКОЗ): 1-я группа – от 0,7 до 0,9, 2-я группа – от 0,3 до 0,6 и 3-я группа – от 0,05 до 0,2. Возраст пациентов варьировал от 40 до 76 лет. Сроки наблюдения после операции составили 12 мес. Пациентам проводилось комплексное офтальмологическое обследование, включающее определение МКОЗ, офтальмометрию, тонометрию, периметрию, биометрию, В-сканирование, а также оптическую когерентную томографию и микропериметрию до операции и в сроки 1 сутки, через 1, 3, 6, 12 мес.

    Пациентам было выполнено хирургическое вмешательство – стандартная трехпортовая 25-27G хромовитрэктомия. Контрастирование ЭРМ проводили послойно с использованием красителя membrane blue dual (DORC, Нидерланды). Далее с помощью эндовитреального пинцета проводили удаление нескольких слоев ЭРМ и внутренней пограничной мембраны (ВПМ). Данные образцы помещались в пробирки с 2,0 мл 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5) в холодильную камеру при температуре +4° С. Через 4 часа их переносили в пробирки с 2,0 мл физиологического раствора. Далее проводили окрашивание и иммуногистохимическое исследование, направленное на выявление и визуализацию следующих антигенов: глиальнокислый фибриллярный протеин (GFAP), TGF-β1, α-SM актин, клеточный ретинальдегид связывающий протеин (CRALBP), фибронектин, CD68, CD45, а также коллаген II, IV, VI типов.

    Результаты и обсуждение

     Согласно результатам исследования эпиретинальные мембраны представляют собой многослойные образования, включающие один или несколько слоев различных типов клеток, произвольно ориентированные волокна экстрацеллюлярного матрикса, фрагменты ВПМ. Глиальные клетки в ЭРМ были представлены клетками Мюллера и астроцитами. Иммуногистохимическим маркером глиальных клеток сетчатки является глиальнокислый фибриллярный протеин (GFAP), клеточный ретинальдегид связывающий протеин (CRALBP) и виментин, который представляет собой целлюлярный филаментобразующий белок, особенно представленный в клетках Мюллера [7]. У пациентов 1 группы во всех исследуемых образцах мембран преобладали GFAP-позитивные астроциты и клетки Мюллера, в небольшом количестве встречались другие типы клеток (макрофаги, гиалоциты, лейкоциты), экспрессирующие коллаген II типа, фибронектин (рис. 1) [14]. В 8-ми случаях были обнаружены CRALBP-позитивные клетки Мюллера, в 2-х – клетки, экспрессирующие одновременно GFAP и α-SM актин (рис. 2). Преобладание астроцитов, клеток Мюллера и клеток с повышенной экспрессией коллагена II типа в образцах данной группы подтверждает начальную стадию пролиферативного процесса. Находясь на поверхности витреоретинального интерфейса, данные клетки со временем «активируются» – подвергаются морфологическим изменениям и трансдифференцировке и начинают проявлять сократительную активность.

    Учитывая данные литературных источников, основным пусковым механизмом, активирующим трансдифференцировку клеток Мюллера в миофибробластоподобные клетки, является выделение фактора роста TGF-β1. Миофибробластоподобные клетки играют одну из ключевых ролей в формировании ЭРМ. Они выделяют компоненты внеклеточного матрикса – фибронектин и коллаген, а также белок α-SM актин – маркер дифференцировки гладкой мускулатуры, обладающий сократительной активностью и способствующий усилению контракции ткани.

    Во 2-й группе во всех образцах были обнаружены GFAP и CRALBP-позитивные астроциты и клетки Мюллера, α-SM актин, а также коллаген II типа и фибронектин (рис. 3). В 17 случаях образцы содержали клетки Мюллера, экспрессирующие одновременно GFAP и CRALBP. Кроме того коллаген IV типа был обнаружен в 90% образцов данной группы. В 15 случаях в составе мембран выявили коллаген VI типа, который представлял собой диффузную тонковолокнистую сеть. Также были выявлены места контакта данной сети с ВПМ. Интересным явилось выявление границы локальной дифференцировки различных типов клеток в миофибробластоподобные в 14 образцах мембран пациентов 2-й группы. На обзорных иммуногистограммах идентифицировали четкий переход GFAP-позитивных клеток в волокнистую сеть, представленную коллагеном. Кроме того, одновременное наличие GFAP и α-SM актина указывает, что в данных образцах присутствовали как активированные клетки Мюллера, так и миофибробластоподобные клетки (рис. 4). Спиралевидное изменение формы глиальных клеток свидетельствует о контрактильных процессах в ЭРМ (рис. 5).

    На основании полученных результатов можно сделать вывод, что основополагающую роль в развитии и прогрессировании ЭРМ играют именно клетки Мюллера и астроциты. В результате их активации и трансдифференцировки в миофибробластоподобные клетки они начинают продуцировать различные типы коллагена и выделяют α-SM актин. Он, в свою очередь, влияет на сократительную активность клеток и способствует контракции мембраны. Таким образом, обнаруженные патоморфологические особенности образцов 2-й группы указывают, что прогрессирование развития ЭРМ сопровождается увеличением количества миофибробластоподобных клеток и коллагена в составе мембраны, что ведёт к её постепенному сокращению и контракции сетчатки.

    Необходимо отметить, что гиалоциты также играют важную роль в процессе образования ЭРМ, способны пролиферировать и трансдифференцироваться в фибробластоподобные клетки. Их маркером является протеин тирозин фосфат – СD45. Активные гиалоциты были обнаружены во всех образцах 2-й группы.

     В образцах мембран 3-й группы выявлено преобладающее количество коллагена VI типа, активных гиалоцитов и α-SM актина, а также отсутствие астроцитов и клеток Мюллера (рис. 6, 7). Полученные данные свидетельствуют о полной трансдифференцировке глиальных клеток в миофибробластоподобные на завершающих этапах фиброгенеза. Данные клетки начинают секретировать факторы роста и белки внеклеточного матрикса, среди которых важнейшим является коллаген. В результате происходит патологическая контракция ткани сетчатки и значительное снижение ее функции.

    Выводы

    1. Процесс формирования ЭРМ представляет собой комплекс последовательных патоморфологических изменений клеток и межклеточного вещества на поверхности ВПМ.

    2. Клинико-морфологическое исследование качественного состава эпиретинальных мембран выявило временную зависимость степени выраженности патологического процесса. Чем больше времени с момента появления жалоб проходит до хирургического лечения, тем ниже острота зрения и более значительные изменения наблюдаются в области витреомакулярного интерфейса.

    3. Прогрессирование процесса заключается в увеличении с течением времени пролиферации, трансдифференцировке глии и других клеточных элементов, интенсивном снижении экспрессии глиальнокислого фибриллярного протеина (GFAP) и конкурентном увеличении продукции α-SM актина миофибробластоподобными клетками, что приводит к избыточной продукции коллагена и обусловливает сократительную способность ЭРМ.

    4. На поздних стадиях формирования эпиретинальные мембраны представляют собой коллагеноволокнистый остов с небольшим количеством клеточных элементов или их отсутствием, плотно фиксированный к сетчатке, удаление которого можно провести только единым блоком с ВПМ.