К настоящему времени изучено большое число генов-кандидатов ДР, выявлены ассоциации вариантов некоторых генов с развитием осложнения, однако слабая степень этих ассоциаций не позволяет прогнозировать развитие ДР у конкретного пациента [20]. Одним из способов повышения прогностической значимости генетических признаков является поиск комбинаций генов, ассоциированных с развитием патологии. Такой подход нашел применение в иммуногенетике [7], популяционной генетике [8], в изучении полигенных болезней, в том числе и сахарного диабета (СД) [5, 6, 14, 22, 28].
В последние годы в патогенезе микрососудистых осложнений СД большая роль отводится хроническому воспалению [1, 2, 15] и нарушениям ангиогенеза [4]. Известно, что регуляция воспалительных реакций и новообразования сосудов осуществляется факторами роста и цитокинами. Мощными ангиогенными и провоспалительными свойствами обладает фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF). Активную роль в регуляции воспаления и ангиогенеза играют интерлейкины-1, -4, -6, -10 (IL-1, IL-4, IL-6, IL-10) и фактор некроза опухолей ? (TNF-?). Ферменты из группы матриксных металлопротеиназ (MMP-2, MMP-3, MMP-9) влияют на проницаемость сосудистой стенки и ангиогенез, регулируя катаболизм компонентов внеклеточного матрикса и клеточно-матриксные взаимодействия [3]. В генах цитокинов и матриксных металлопротеиназ обнаружены полиморфные участки, варианты нуклеотидов в которых оказывают влияние на уровень экспрессии генов [3, 7].
Взаимосвязь полиморфных вариантов гена VEGF с развитием ДР у больных СД 2-го типа подтверждена в недавних мета-анализах [9, 21].
В отдельных исследованиях выявлены ассоциации полиморфных вариантов генов других цитокинов и матриксных металлопротеиназ с ДР [16, 23, 29] и пролиферативной ДР [11, 19].
Таблица 1 Клинико-лабораторная характеристика групп
Таблица 2 Комбинированные генетические признаки, ассоциированные с предрасположеннос тью к развитию ДР
Изучение ассоциаций комбинированных генетических признаков, включающих варианты генов цитокинов (IL1В, IL4, IL6, IL10, TNFА, VEGF) и матриксных металлопротеиназ (MMP2, MMP3, MMP9), с ДР у больных СД 2-го типа (СД2).
Материал и методы
Обследовано 103 женщины европеоидного происхождения с СД2 в возрасте от 50 до 70 лет (медиана – 62 года). Избыточная масса тела имелась у 27 женщин, ожирение – у 71. Артериальная гипертензия диагностирована у 99 обследованных, дислипидемия – у 66, диабетическая нефропатия – у 52. Метформин получали 69 пациенток, препараты сульфонилмочевины – 43, глитазоны – 7. Инсулинотерапия проводилась у 65 пациенток, 19 из них получали базальный инсулин, 20 – комбинированные инсулины, 26 – базис-болюсную инсулинотерапию.
Уровень гликированного гемоглобина (HbA1c) варьировал от 3,8 до 12,1%, с медианой 7,2%.
Комплекс стандартного офтальмологического обследования включал определение остроты зрения, офтальмоскопию с широким зрачком, тонометрию, биомикроскопию хрусталика и стекловидного тела. По показаниям выполнялись флуоресцентная ангиография сетчатки, оптическая когерентная томография (в Новосибирском филиале МНТК «Микрохирургия глаза»). Больные с катарактой и другой сопутствующей офтальмологической патологией в исследование не включались.
В основную группу вошли 49 пациенток с ДР (группа ДР+), в том числе 45 – с непролиферативной ретинопатией, одна – с препролиферативной и 3 – с пролиферативной ретинопатией. 9 больным ранее выполнялась лазеркоагуляция сетчатки. 54 обследованных без ДР составили группу сравнения (группа ДР-).
Исследовано 13 точек полиморфизма промоторных регионов генов: VEGF: А2578С и С936Т, IL1В: С31Т, IL4: С590Т, IL6: G174C, IL10: A592C и А1082G, TNFА: А238G, A308G и A863C, MMP2: T1306C, ММР3: 5A/6A, MMP9: С1562T. Для исследования отобраны точки полиморфизма, ассоциированные с высокими или низкими уровнями продукции и сывороточной концентрации кодируемых этими генами регуляторных молекул. Генотипирование осуществляли методом рестриктного анализа продуктов амплификации. Участки промоторного региона генов амплифицировали с использованием пары специфичных праймеров, затем продукты амплификации подвергали гидролизу соответствующими эндонуклеазами рестрикции («СибЭнзим», Новосибирск). Электрофорез проводили в 2%-ном агарозном геле [8].
При статистическом анализе результатов рассчитывали частоту встречаемости генов, генотипов и их комбинаций, отношение шансов (OR) и его 95%-ный доверительный интервал (OR95%CI), специфичность (Sp). Частоту встречаемости отдельных генотипов и их комбинаций определяли как процентное отношение индивидов, несущих генотип (комбинацию генотипов), к общему числу обследованных в группе по формуле: f=n/N, где n – количество раз встречаемости генотипа (комбинации), N – численность обследованных. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга.
Достоверность различий частот распределения изучаемых признаков в альтернативных группах определяли по критерию ?2 с поправкой Йетса на непрерывность и двустороннему варианту точного метода Фишера для четырехпольных таблиц.
Результаты и обсуждение.
Как видно из табл. 1, группы больных достоверно не различались по возрасту, индексу массы тела, уровню HbA1c, триглицеридов и скорости клубочковой фильтрации. Длительность СД была ожидаемо больше у больных с ДР. Уровень общего холестерина оказался несколько ниже, а уровень гемоглобина – несколько выше у пациенток с ДР.
При анализе комбинированных генетических признаков, включающих полиморфные позиции генов факторов роста (VEGF, TNFА), цитокинов (IL1В, IL4, IL6, IL10) и матриксных металлопротеиназ (MMP2, MMP3, MMP9), выделено 37 комбинаций, ассоциированных c ДР с вероятностью р<0,01. Комбинации с наибольшим значением OR (более 10) представлены в табл. 2. Оказалось, что в составе комбинированных признаков, наиболее тесно связанных с ДР, с наибольшей частотой встречаются гомозиготные варианты GG в полиморфных позициях -308 и -238 гена TNFА (35 и 17 комбинаций соответственно), вариант 31TT гена IL1В (10 комбинаций), вариант 590СС гена IL4 (11 комбинаций) и гетерозиготные варианты GС в позиции -174 гена IL6 (36 комбинаций). Сочетание этих четырех генотипов показало наибольшую ассоциацию с ДР (OR=24,16). В состав других комбинаций, связанных с ДР, входили гомозиготные варианты 936СС гена VEGF, 592СС гена IL10 и 1562СС гена MMP9, а также гетерозиготный вариант 5A/6A гена ММР3.
В составе 11 комбинаций, ассоциированных с отсутствием ДР (табл. 3), преобладали гетерозиготные варианты 308GА гена TNFA и 1082AG гена IL10. Данные варианты входили в состав 7 генетических комбинаций. С меньшей частотой встречались гомозиготные варианты: 238GG гена TNFA, 31СC IL1В, 6A/6A ММР3 и 1306СC ММР2.
Очевидны различия в аллельных вариантах генов цитокинов и матриксных металлопротеиназ в комбинациях, ассоциированных с предрасположенностью и «резистентностью» к развитию ДР. Поскольку данные варианты связаны с различной интенсивностью транскрипции генов, можно предполагать их патогенетическую связь с формированием осложнения.
Среди вариантов генов цитокинов, ассоциированных с ДР, обращает внимание гомозиготный вариант 936CС гена VEGF. В настоящее время VEGF рассматривается как ключевой медиатор в развитии ДР, способствующий повышению проницаемости сосудов сетчатки, развитию иммуновоспалительных реакций и неоваскуляризации [13]. Гомозиготный вариант 936CС гена VEGF ассоциирован с повышением продукции фактора [3].
В составе комбинаций, чаще встречающихся у пациентов с ДР, выявлены гомозиготные варианты генов противовоспалительных цитокинов (IL-4 и IL-10), аccоциированные с низкой продукцией регуляторов [12, 25]. Генотип провоспалительного и ангиогенного цитокина IL-1β, напротив, был представлен гомозиготным вариантом ТТ, сочетающимся с высоким уровнем продукции [27]. В группе «протективных» комбинаций обнаруживался вариант СС данного гена. Имеются данные, что IL-1β способствует развитию иммуновоспалительных реакций и повреждению эндотелия ретинальных сосудов при ДР [26]. Увеличение продукции IL-1β в сетчатке обнаружено при экспериментальном СД [17] и у пациентов с пролиферативной ДР [30]. «Нокаутирование» гена IL-1β у мышей с СД тормозит развитие ретинопатии [26].
Можно предположить, что генетически детерминированный дисбаланс между про- и противовоспалительными цитокинами способствует развитию ДР.
Нами впервые показаны различия в генотипах матриксных металлопротеиназ в составе генетических комбинаций, ассоциированных с предрасположенностью и устойчивостью к ДР. В частности, в составе «предрасполагающих» комбинаций встречался гетерозиготный вариант 5A/6A гена ММР3, в то время как «протективные» комбинации включали гомозиготный вариант 6A/6A.
Было показано, что носители варианта 6А/6А имеют наименьшую экспрессию фермента в сосудистой стенке [18], вариант 5А/5А MMP3 ассоциирован с аневризмами коронарных артерий и инфарктом миокарда [10]. Можно предположить, что больные СД2 с генотипом 6А/6А MMP3 имеют более «прочную» стенку ретинальных сосудов, уменьшающую риск возникновения кровоизлияний, экссудатов и микроаневризм.
Таким образом, генетически детерминированные особенности экспрессии цитокинов и матриксных металлопротеиназ могут способствовать развитию иммунного воспаления и увеличению проницаемости сосудов сетчатки, активации ангиогенеза и прогрессированию ДР.
Вероятно, генные сети цитокинов и матриксных металлопротеиназ могут использоваться с целью персонификации прогноза развития ДР у больных СД2.
Заключение
Проведенное исследование выявило особенности генных сетей цитокинов и матриксных металлопротеиназ, определяющих особенности воспалительных реакций и ангиогенеза, у женщин с СД2, осложненным ДР. В составе генетических комбинаций, ассоциированных с ДР, присутствует большое число гомозиготных вариантов в полиморфных позициях генов VEGF, TNFА, IL1В, IL4, IL10 и MMP9. Комбинации, ассоциированные с устойчивостью к ДР, включают гетерозиготные варианты генов TNFА и IL10, а также гомозиготные варианты IL1В, MMP2 и ММР3. Значимость выделенных комбинаций как предикторов развития ДР нуждается в дальнейших исследованиях.
