Рис. 1. Состояние глазного дна кролика на 1-е сутки после фотодинамического воздействия
Рис. 2. Состояние глазного дна кролика на 1-е сутки после лазеркоагуляции
Изучение вопросов патогенеза и лечения заболевания возможно только в условиях эксперимента, поэтому актуальным является создание адекватных моделей тромбозов ветвей ЦВС.
Существующие на сегодняшний день экспериментальные модели, получаемые лазерными и хирургическими способами, травматичны, отличаются высоким риском осложнений, низкой воспроизводимостью и преходящим характером тромбоза [8, 10, 12-15, 17].
Рис. 3. Фотоиндуцированная модель тромбоза притока ЦВС (1 сутки). Полнокровие вен, способствующее агрегации форменных элементов крови с явлениями сладж-синдрома, повышенная проницаемость сосудистой стенки, диапедезные кровоизлияния, мелкие кровоизлияния в кортикальных слоях стекловидного тела глаза и слоях сетчатки. Окраска гематоксилин-эозином, ув. х200
Рис. 4. Фотоиндуцированная модель тромбоза притока ЦВС (3 сутки). В ЦВС на месте разрушенного эндотелия отмечали отложение фибрина, скопление лейкоцитов с формированием пристеночного «красного» тромба из-за обильного пропитывания эритроцитами (а). В венулах неравномерное тромбирование, чередование сохранения просвета сосуда и появление в стенках «сосудистых почек» — развитие неоваскуляризации (б). Окраска гематоксилин-эозином, ув. х200
На наш взгляд, наиболее патогенетически обоснованным для создания моделей тромбозов ветвей ЦВС является использование фотодинамического эффекта, основой которого выступает фототоксическое повреждение эндотелия сосудов, приводящее к стазу и агрегации клеток с последующей окклюзией [2, 6, 7, 9, 11, 16].
Цель
Провести сравнительный анализ фотоиндуцированной модели тромбоза ветви ЦВС с моделью, полученной посредством лазеркоагуляции.
Материал и методы
Экспериментальное моделирование тромбоза ветви ЦВС выполнено на 20 кроликах (20 глаз) породы Шиншилла весом 1,5-2 кг. Животные были разделены на две группы: у 10 кроликов (10 глаз) моделирование тромбоза осуществляли посредством фотодинамического воздействия, у оставшихся 10 кроликов (10 глаз) — посредством лазерного воздействия.
Для фотодинамического воздействия использовали фотосензибилизатор (ФС) хлоринового ряда — бис-N-метилглюкаминовую соль хлорина e6. ФС вводили внутривенно в дозе 2,4 мг/кг веса животного. Через 10 минут (время, достаточное для максимального накопления ФС в сосудах сетчатки по данным флуоресцентной диагностики [1]) транспупиллярно проводили лазерное облучение ретинальных сосудов на выходе из диска зрительного нерва с плотностью энергии 80 Дж/см2 при помощи лазерного офтальмо-микрохирургического комплекса «АЛОД-01» («Алком-Медика», Санкт-Петербург) с длиной волны 662 нм. Диаметр пятна лазерного излучения составлял 3,0 мм.
Высокоинтенсивную лазеркоагуляцию проводили на лазерном аппарате «Ultima» с длиной волны 532 нм. Лазеркоагуляты наносились с перекрытием соседних, на вену в месте выхода из ДЗН, в количестве 30-40, пятном 200 мкм, с экспозицией 0,15 нс, мощностью 200-240 мВт, до получения устойчивого спазма сосуда.
Рис. 5. Лазеркоагуляционная модель тромбоза притока ЦВС (1 сутки). Разрушение сосудов на поверхности сетчатки, компенсаторное гемостатическое тромбирование, спазм сосудов. Окраска гематоксилин-эозином, ув. х200
Рис. 6. Лазеркоагуляционная модель тромбоза притока ЦВС (7 сутки). Неполная облитерация поверхностных вен сетчатки с мелкими кровоизлияниями (а), приводящими к компенсаторному расширению просвета ЦВС, сопровождающаяся выраженной периваскулярной макрофагальной воспалительной реакцией (б). Окраска гематоксилин-эозином, ув. х200
Для проведения морфологических исследований энуклеированные глазные яблоки фиксировали в растворе нейтрального формалина, подвергали макромикроскопическому препарированию, затем промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин, выполняли серии меридиональных гистологических срезов с применением окраски гематоксилин-эозином. Препараты изучали под микроскопом «Leica DM LB2» при 50-, 200-, 400-кратном увеличении с последующим фотографированием.
Результаты
Офтальмоскопически на фотоиндуцированных моделях через 30 минут после фотодинамического воздействия отмечали сужение артерии, расширение, извитость и напряжение пораженной вены; вдоль сосудистой аркады — множественные интраретинальные штрихообразные кровоизлияния; отек перипапиллярно по ходу сосудистой аркады и в центральной зоне сетчатки; границы диска зрительного нерва слегка смазаны. К первым суткам количество геморрагий увеличилось, отмечалось большое число экстравазатов вокруг пораженного сосуда, отек тканей усиливался (рис. 1). На 3-и сутки число геморрагий и экстравазатов уменьшалось, отек тканей нарастал и достигал пика. Тромбированная ветвь была полнокровной, имела патологическую извитость, четкообразность, темную окраску, отмечалось появление микроаневризм, расширение капиллярной сети. К 7-м суткам наблюдали дальнейшее уменьшение геморрагий и экстравазатов, вена сохраняла патологическую извитость, неравномерный калибр и темную окраску, соответствующая артерия имела прямолинейный ход, была сужена, отмечался симптом «серебряной проволоки», отек тканей уменьшился. К 14-му дню кровоизлияния частично рассасывались, однако отек сетчатки над пораженной аркадой и центральной зоной сохранялся, что подтверждалось данными ОКТ.
На глазах, подвергнутых лазеркоагуляции, в первые сутки фиксировались единичные кровоизлияния в области пораженного сосуда (рис. 2), которые усиливались к третьему дню наблюдения. Только к 7-м суткам отмечалась картина тромбоза с расширением, извитостью, нарушением кровотока в пораженном сосуде и кровоизлияниями вдоль пораженной вены, отеком сетчатки парапапиллярно, в зоне воздействия и в зоне проекции макулы. К 14-му дню кровоизлияния и отек сохранялись, формировалась атрофия зрительного нерва.
По данным флуоресцентной ангиографии на фотоиндуцированных моделях в 1-е сутки выявлялось отсроченное заполнение контрастом окклюдированного венозного сосуда по сравнению с другими ветвями ЦВС, кровоток в поврежденном сосуде был резко затруднен, в области формирования тромба сосудистая стенка прокрашивалась контрастным веществом, отмечалось удлинение венозной перфузии, неравномерное контрастирование вен. К 3-м суткам окклюдированный сосуд не заполнялся контрастом и выглядел темным, тогда как остальные ветви ЦВС были заполнены флуоресцеином, отмечалось сужение артерий, отсутствие нормального ветвления. В бассейне пораженного сосуда отмечалось отсутствие перфузии в капиллярах сетчатки, на границах зон ишемии капилляры были резко расширены и имели вид «обрубков», что особенно хорошо проявлялось на 7-е сутки наблюдения. В этих же зонах выявлялись капиллярные аневризмы, отмечался выход флуоресцина за пределы сосуда. В поздних фазах наблюдался гиперфлуоресценция ДЗН и в зонах отека сетчатки, перфузия в перифовеолярных капиллярах была нарушена.
На моделях, полученных путем лазеркоагуляции, наблюдалось замедление контрастирования пораженного сосуда в 1-е сутки, прокрашивание окружающих тканей флуоресцином. В первые три дня отмечалось нарушение целостности сосудистой стенки, гиперфлуоресценция в зонах отека сетчатки. К 7-м суткам контрастирование сосуда отсутствовало.
По данным ОКТ на фотоиндуцированных моделях в 1-е сутки толщина сетчатки увеличилась на 60-70 мкм — в среднем до 199 мкм (толщина интактной сетчатки — до 132 мкм), определялись участки серозной отслойки нейроэпителия парапалиллярно (высотой до 357 мкм), а также множественные преретинальные и интраретинальные кровоизлияния. При исследовании на 3-и сутки зон экссудативной отслойки нейроэпителия выявлено не было, однако сохранялся диффузный отек сетчатки, достигавший своего пика (высотой до 210 мкм). На 7-е сутки после эксперимента происходила частичная резорбция отека (высотой до 170 мкм). Через 2 недели начинал формироваться неравномерно пигментированный хориоретинальный атрофический очаг, местами сохранялись участки отека сетчатки (высотой до 145 мкм).
После лазеркоагуляции в 1-е сутки отека сетчатки не наблюдалось, отмечались единичные интраретинальные кровоизлияния. К третьим суткам толщина сетчатки увеличилась до 170 мкм, количество геморрагий существенно возросло. На 7-е сутки отек достигал своего пика (до 200 мкм), а к 14-суткам происходила частичная его резорбция (до 150 мкм).
По данным морфологических исследований на фотоиндуцированных моделях на 1-е сутки отмечали выраженный отек ДЗН и перипапиллярных участков сетчатки, полнокровие всех сосудов этой зоны, способствующее агрегации форменных элементов крови с явлениями сладж-синдрома (рис. 3). В поверхностных венулах наблюдали значительное повышение проницаемости сосудистой стенки, что привело к диапедезным кровоизлияниям без нарушения целостности сосудов. Свободные эритроциты оседали с формированием мелких кровоизлияний в кортикальных слоях стекловидного тела глаза, но основная масса их пропитывала сетчатку, усугубляя ее структурные нарушения. К 3 суткам явления отека нарастали, особенно он был выражен в начальном отрезке зрительного нерва, но кровоизлияния носили очаговый поверхностный характер, в основном в слое нервных волокон перипапиллярной сетчатки. Сладж-синдром перешел в тромбоз крупных сосудов, в ЦВС на месте разрушенного эндотелия отмечали отложение фибрина, скопление лейкоцитов с формированием пристеночного «красного» тромба из-за обильного пропитывания эритроцитами. В венулах тромбирование было неравномерным, выявлено чередование с сохранением просвета сосуда и появлением в стенках «сосудистых почек» — развитие неоваскуляризации (рис. 4а, б). К 7 суткам количество новообразованных сосудов увеличивалось. На фоне неравномерного тромбирования и частичной облитерации мелких сосудов на внутренней поверхности сетчатки они сохранялись в ее толще, особенно в отечной части слоя нервных волокон оптикоганглионаров «зрительной лучистости» вблизи ДЗН. Недосформированность стенки новообразованных сосудов приводила к появлению мелких диапедезных экстравазатов. По истечении двух недель пролиферативные процессы сменялись инволютивными. Отмечено сохранение неравномерной отечности, очаговый глиоз сетчатки, замещение фиброзной тканью участков деструкции оболочек и зрительного нерва с тенденцией к формированию хориоретинального рубца.
На моделях, полученных посредством лазеркоагуляции, в 1-е сутки преобладали альтерационные явления, обусловленные повреждающим действием лазера. Стенки мелких сосудов были разрушены, вследствие нарушения целостности сосудистой стенки — появление геморрагий. Механизмы тромбирования направлены на закрытие дефектов сосудов, поэтому за счет участия многофакторной внутренней системы гемостаза отмечали, в отличие от фотоиндуцированной модели, не дилятацию, а спазм венул, в формировании тромба принимали участие в равной степени как внутрисосудистые, так и тканевые компоненты (рис. 5). К третьим суткам расширялась зона ишемического некроза, также как и в фотоиндуцированной модели отмечали начальные элементы компенсаторной неоваскуляризации, продолжали появляться новые очаги кровоизлияний на поверхности отечных тканей зрительного нерва и сетчатки. К седьмым суткам к имеющимся явлениям присоединилась выраженная макрофагально-воспалительная периваскулярная инфильтрация как реакция на обширные очаги некротической ткани и организующихся отдельных кровоизлияний (рис. 6а, б). Притоки ЦВС были подвержены частичной облитерации, что приводило к ее полнокровию.
Обсуждение
Впервые модель тромбоза ветви ЦВС была получена около 30 лет назад Kohner et al. [14]. Для получения моделей тромбоза ветви ЦВС исследователи обычно применяли высокоинтенсивную лазеркоагуляцию и другие более инвазивные хирургические методы [8, 10, 12-15, 17]. В результате использования высокоинтенсивной лазеркоагуляции создавали модели тромбозов ветвей ЦВС с ретинальной и оптической неоваскуляризацией, на которых изучались многие вопросы патогенеза и ангиогенеза, а также разрабатывались некоторые методы лечения. Преимуществами этих моделей являлись простота получения и относительная неинвазивность методики. Однако их создание сопровождалось высоким риском интравитреальных кровоизлияний, а положительные результаты получали лишь в 50% случаев, и они носили преходящий характер [8, 10, 12-14].
В последние годы появились единичные публикации, описывающие фотоиндуцированную модель тромбозов ветвей вен сетчатки у экспериментальных животных, преимуществами которой является селективность, направленность воздействия, меньшая травматичность. Такие достоинства метода связаны с избирательным поражением клеток эндотелия сосудов и минимальным воздействием на окружающие ткани [2, 6, 7, 9, 11, 16]. Исходя из этого, получение тромбоза с использованием фотодинамического воздействия является патогенетически более обоснованным в сравнении с ранее существующими методиками, так как механизм формирования тромба в естественных условиях связан именно с повреждением эндотелиальных клеток без нарушения целостности сосудистой стенки.
В наших исследованиях мы получили фотоиндуцированную модель, что офтальмоскопически проявлялось картиной тромбоза ветви ЦВС уже в 1-е сутки после воздействия. В течение следующих дней картина нарастала и достигала пика к третьему дню. Затем наблюдалось частичное рассасывание кровоизлияний с формированием микроаневризм. На всех сроках наблюдения отмечался отек сетчатки различной степени выраженности, что подтверждалось данными ОКТ.
Модели, получаемые с помощью лазеркоагуляции, в первые сутки после воздействия отличались скудностью офтальмоскопической картины: небольшое расширение и извитость поврежденного сосуда и единичные геморрагии, обусловленные разрушением мелких сосудов. Усиление кровоизлияний, отек сетчатки, запустевания пораженного сосуда выше места окклюзии начинали проявляться лишь с третьего дня и достигали пика только к 7-м суткам.
Следовательно, клиническая картина новой модели, а также острый характер ее возникновения, в отличие от ранее предложенных, полностью соответствует клиническим проявлениям тромбоза ветви ЦВС, что указывает на ее адекватность и легковоспроизводимость.
Ангиографически на фотоиндуцированных моделях показано нарушение кровотока в поврежденном сосуде, а к 3-м суткам полное отсутствие контрастирования сосуда. Отмечается прокрашивание окружающих тканей, что указывает на отек сетчатки, а в последующем — наличие темных зон ишемии сетчатки и формирование микроаневризм. Это подтверждает формирование тромба в зоне фотодинамического воздействия.
На моделях, полученных при помощи лазеркоагуляции, отмечалось пропитывание окружающих тканей флуоресцином, нарушение целостности сосудистой стенки, к третьему дню формировались контуры сосуда, его контрастирование отсутствовало. Этот факт не соответствует механизму тромбообразования, так как первичным является формирование тромба, а кровоизлияние и нарушение целостности стенки сосуда вторично.
Гистологически уже на первые сутки были отмечены предрасполагающие факторы тромбообразования в ЦВС (повреждение эндотелия, сладж-синдром, повышенная проницаемость сосудистой стенки, отек), способствующие агглютинации тромбоцитов и коагуляции фибриногена. Далее усиливалось пристеночное внутрисосудистое прикрепление тромба, появление дополнительных фиброзных структур, оседание на них форменных элементов крови, все больше перекрывающих просвет сосуда. Эти процессы сопровождались отеком и ишемическими изменениями в близлежащих оболочках с компенсаторным развитием неоваскуляризации. Данная морфологическая картина полностью подтверждала наличие тромба, формирование и строение которого соответствует патогенезу образования тромба в естественных условиях.
На моделях, полученных методом лазеркоагуляции, отмечалось нарушение целостности сосудистой стенки, в месте поражения возникало компенсаторное тромбирование (приток тромбоцитов и лимфоцитов), спазм сосудов, гемофтальм из разрушенных сосудов, т.е. отмечался застой клеток крови, а не первичное формирование полноценного тромба в просвете сосуда.
Заключение
Офтальмоскопическая, ангиографическая и морфологическая картина фотоиндуцированной модели, а также острый характер ее возникновения полностью соответствуют проявлениям тромбоза ветви ЦВС, что указывает на адекватность, легковоспроизводимость и патогенетическую направленность полученной модели по сравнению с моделями, индуцированными лазеркоагуляцией.
Мы полагаем, что использование фотоиндуцированной модели является перспективным и целесообразным при разработке новых методик лечения тромбоза ветвей ретинальных вен, а также для изучения различных вопросов патогенеза данного заболевания.
