Рис. 1.Обнаружение ВПГ в культуре клеток
Рис. 2.Электронная микроскопия клеток, зараженных ВПГ (http://www.mdpi.com/1999-4915/7/10/2890/htm)
Этиологическая диагностика герпетических поражений глаза зависит не столько от чувствительности и специфичности выбранной методики, сколько от правильного их сочетания и персонализированного подхода. Кроме того, в офтальмологической практике возможность проведения лабораторного исследования зависима от возможности получения клинического материала. Наиболее легким, неинвазивным и безопасным для пациента является исследование слезной жидкости, биоматериала из конъюнктивы и роговицы. В то же время, инвазивный метод взятия образцов влаги передней камеры и стекловидного тела не во всех случаях является оправданным.
При любом выбранном подходе к вирусной диагностике одним из важнейших факторов является клиническая стадия заболевания в момент отбора материала, качество исследуемого материала, среда для его взятия и транспортировка. Так, например, для прямого анализа образца или для изоляции вируса герпеса исследуемый материал должен быть получен в достаточном объеме в самом начале заболевания, когда возбудитель еще репродуцируется в относительно больших количествах и пока не связан антителами.Также важен выбор материала в соответствии с предполагаемой клинической формой заболевания, то есть того материала, в котором, исходя из патогенеза инфекции, вероятность присутствия вируса наибольшая.
Наиболее быстрыми методами, которые позволяют обнаружить вирус, вирусный антиген или вирусную нуклеиновую кислоту непосредственно в клиническом материале, являются прямые методы (2-24 ч.). Однако из-за ряда особенностей возбудителей, ограничений по использованию прямых методов (возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов) необходимо проводить подтверждение результатов непрямыми методами [3].
Цитологический метод диагностики офтальмогерпеса может быть использован в комплексе диагностических приемов для выяснения этиологии острых вирусных конъюнктивитов и герпетического кератита, однако имеет лишь вспомогательное значение.
«Золотым стандартом» являетсяизоляция вируса.Для выделения вирусов используют культуры клеток, лабораторных животных, эмбрионы кур. Процесс длительный, трудоемкий, иногда требующий проведения нескольких пассажей, прежде чем вирус будет обнаружен и идентифицирован (рис. 1). Условием успешного результата является взятие клинического материала в наиболее ранние сроки. В 90% случаев герпетического древовидного кератита вирус выделяется в течение первой недели заболевания, преимущественно (70%) – в первые 4 дня болезни [4]. При герпетических поражениях глаз в большинстве случаев обнаруживают вирус простого герпеса(ВПГ) типа 1, причем частота изоляции данного вируса, по данным разных авторов, варьирует от 6 до 34% случаев [5].
Альтернативой выделению вирусов являются методы иммунофлюоресцентного и электронномикроскопического изучения клеточных культур, зараженных материалом от больного, позволяющие выявить возбудителя в исследуемом образце в течение нескольких часов (рис. 2).
Среди серологических методов наиболее часто используется метод иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на реакции антиген – антитело. Исследуют парные сыворотки крови, взятые с интервалом в 2–3 недели, т.е. в начале заболевания и в периоде реконвалесценции. Реакция считается положительной при нарастании титра антител не менее, чем в 4 раза. Однако интерпретация результатов может затрудняться персистенцией вирусов герпеса в организме человека и высокой частотой серопозитивных лиц среди взрослого населения. К тому же, определение антител (АТ) класса иммуноглобулинов (Ig)G и IgM к вирусам может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты [6, 7]. В частности, при ВПГи ЦМВ (цитомегаловирус)-инфекциях отмечается длительная (до 6 мес.) персистенция IgM в крови, либо отсутствие его синтеза при иммунодефицитах [8]. Поэтому специфические IgG к герпесвирусам ряд авторов рассматривает лишь как маркеры персистентной инфекции, а ее активацией считают появление IgM, IgG и IgА к предранним неструктурным белкам этих вирусов, которые выявляются в сыворотке крови более, чем у 80% больных древовидным герпетическим кератитом, 40% – иридоциклитом и 30% – увеитом и хориоретинитом неясного генеза [8, 9]. Определение низкоавидного IgG к ВПГ может быть наиболее специфичным маркером, как правило, только у детей с первичной герпесвирусной инфекцией.
С целью прогноза рецидива герпетического кератита (ГК) предлагается в динамике заболевания методом иммуноферментного анализа (ИФА) определять уровень секреторного иммуноглобулина (sIgG) в слезной жидкости и оценивать его значение в корреляции с уровнем сывороточных антител к ВПГ [10]. Диагностическое значение имеет количественное определение в одном образце сыворотки крови антител класса IgG к ВПГ в высоком титре, равном 1:3200 [9, 11].
При изучении величины титров IgM и IgG к ВПГ в острой стадии древовидного герпетического кератита были установлены диагностически значимые уровни [5]. Максимальная концентрация IgМ (1:800) в крови выявляется на 6-е сутки заболевания, тогда как IgG (1:12800) – только на 20-е сутки. Аналогичный показатель величины титра IgG (1:12800), определяющий активность герпесвирусной инфекции у беременных, был предложен ранее М.Т. Луценко (2008).
В настоящее время широкое распространение имеют молекулярные методы, в частности, полимеразная цепная реакция (ПЦР), с помощью которой выделяют геномы вируса. Метод высокоспецифичен и очень чувствителен, позволяет обнаружить даже несколько копий вирусной ДНК в исследуемом материале, а также эффективнее контролировать реактивацию некоторых вирусных инфекций уже на ранних стадиях или даже в доклиническую фазу [12].
С помощью этого метода можно проводить дифференциальную диагностику герпетических инфекций, вызванных ВПГ, цитомегаловирусом (ЦМВ) и вирусом опоясывающего лишая (herpesZoster) [13-15].
Известно, что антиген ВПГ значительно чаще выявляется методами ПЦР и иммунофлуоресцентного исследования в соскобах с конъюнктивы и роговицы, и несколько реже – в слезной жидкости. Согласно данным ряда авторов, ПЦР-диагностика герпетической инфекции в образцах конъюнктивы обладает чувствительностью 77,8%, специфичностью – 92,1% [16]. Исследование слезы при ГК можно проводить в случае невозможности взятия материала с роговицы[17].
Результаты многоцентрового, проспективного, рандомизированного, простого слепого и контролируемого клинического исследования показывают, что с помощью метода Real-Time ПЦР есть возможность уточнить этиологию предполагаемого стромального ГК с изъязвлением роговицы еще до началалечения и значительно ускорить принятие решения по этиологически ориентированной терапии. При этом следует также учитывать, что на ранних стадиях заболевания наиболее эффективно исследование соскобов с эпителия роговицы, чем слезной жидкости (46,4% против 13,3%), так как в последней копии ДНК ВПГ становятся обнаруживаемыми позже, когда репликация вируса в клетках эпителия роговицы достигает достаточно высокой концентрации. Так, в данном исследовании ДНК ВПГ определяется в слезной жидкости при концентрации вируса в соскобах с эпителия роговицы выше 105 копий/мл у 80% пациентов. Причем до лечения концентрация ВПГ в соскобах с эпителия роговицы прямо коррелирует с клиническими проявлениями кератита (р=0,844, p< 0,0001) [18].
Имеется множество сообщений, положительно оценивающих эффективность ПЦРв режиме реального времени для исследования образцов внутриглазных жидкостей (влаги передней камеры, стекловидного тела) при этиологической диагностике офтальмогерпеса, особенно увеита [14, 15, 19, 20]. Лучшим материалом для молекулярной диагностики инфекционного увеита считается в первую очередь стекловидное тело, а только затем влага передней камеры [21]. Исследование внутриглазной жидкости (ВГЖ) методом ПЦР может оказаться весьма полезным в случае локализации воспалительного процесса в заднем отделе глазного яблока, когда вследствие непрозрачности оптических сред или окклюзии зрачка синехиями нет возможности установить диагноз на основании клинических данных [22]. Так, исследование ВГЖ методом ПЦР показывает, что наиболее частыми причинами заднего увеита инфекционной этиологии в популяции с высокой распространенностью ВИЧ-инфекции являются ЦМВ (47%), ВВО (11%) и токсоплазмоз (10%) [23].
Обнаружение высоких концентраций вируса в глазных жидкостях указывает на то, что репликация вируса происходит именно в тканях глаза,свидетельствуя о прямой патогенной роли вирусов при внутриглазном воспалении.
Исследование биологических секретов методом ПЦР позволяет установить этиологию офтальмогерпеса и начать активную противовирусную терапию в 80% случаев [24]. Так, у пациентов с острой фазой увеита для подтверждения этиологического диагноза может применяться количественное исследование ВГЖ методом ПЦР. При хроническом увеите более полезно определение местной продукции внутриглазных антител против вируса или соотношения между содержанием АТ во внутриглазной жидкости и сыворотке крови (коэффициента Goldmann-Witmer). Результат данного коэффициента считается положительным при превышении значения более трех. У пациентов с ослабленной иммунной системой наиболее информативно проведение ПЦР-анализа, чем определение коэффициента Goldmann-Witmer. Одновременное применение обоих тестов значительно повышает качество диагностики [13]. Cуществует, однако, и другое мнение. Применение ПЦР с диагностической целью путем взятия внутриглазных жидкостей в ежедневной практике офтальмолога не оправдано вследствие инвазивности методики и вероятности осложнений [7, 21, 25].
В последние годы для ранней диагностики офтальмогерпеса появился более специфичный и чувствительный метод модифицированной ПЦР, представляющий собой ее комбинацию в режиме реального времени с ОТ-ПЦР (обратная транскрипция), который позволяет быстро обнаружить даже низкие концентрациивируса [26]. Тем не менее, результаты лабораторных данных ни в коем случае нельзя трактовать без учета клинической картины, которая была и остается важнейшим критерием ранней диагностики [27].
Таким образом, при невозможности установления клинического диагноза «офтмальмогерпес» применяют методы лабораторного исследования, такие как количественная полимеразная цепная реакция и иммуноферментный анализ. На современном этапе ПЦР является наиболее точным из всех существующих методик лабораторной диагностики вирусных заболеваний глаз.Возможности лабораторного уточнения герпетической этиологии при воспалительных заболеваниях глаз, неподдающихся клинической диагностике, расширились с появлением количественного метода ПЦР, что важно для раннего назначения этиотропной терапии и получения более высоких визуальных результатов. Однако наиболее оптимальным для установления этиологического диагноза при инфекционных заболеваниях глаза является сочетание тестов ПЦР и ИФА.
