Рис. 1. Периферический ожог роговицы. Опытная группа. Дефект роговицы (истончение) с повреждением лимбальной области в области термического воздействия, выраженный блефароспазм и отек окружающих тканей (слева). К 30-м суткам отмечается диффузное стромальное помутнение (справа)
Рис. 2. Периферический ожог роговицы. Контрольная группа. Дефект роговицы (истончение) с повреждением лимбальной области, выраженный блефароспазм и отек окружающих тканей (слева). К 30-м суткам наблюдается формирование васкуляризированного бельма роговицы (справа)
Одним из перспективных направлений профилактики данного осложнения является использование стволовых или прогениторных клеток, получаемых как из костного мозга, так из лимбальной области [3, 4, 6, 8]. Паракринные факторы, выделяемые стволовыми клетками, обладают противовоспалительным, антиапоптотическим действием. Показано, что трансплантация стволовых клеток при химическом ожоге роговицы тормозит рост новообразованных сосудов и тем самым сохраняет оптические свойства глаза. Однако существуют факторы, препятствующие клиническому применению данного метода. Так, в случае ожоговой травмы трансплантацию клеток в поврежденную область необходимо провести в течение первых 12 часов, что делает невозможным использование аутологичных (собственных) стволовых клеток, поскольку нет времени для их выделения и культивирования. Применение аллогенных клеток возможно только после их предварительного криоконсервирования и последующей разморозки перед трансплантацией, что негативным образом влияет на жизнеспособность и функциональную активность трансплантированных клеток.
Одним из решений является использование в лечении и профилактике осложнений при ожоговой болезни глаза пептидов, полученных из культивированных стволовых клеток. Очищенный и лиофилизированный препарат, содержащий паракринные факторы, может быть эффективен в профилактике неоваскуляризации роговицы [7].
Цель
Изучение влияния раствора пептидов на репаративные свойства роговицы на экспериментальной модели неоваскуляризации роговицы.
Материал и методы
Исследование проведено на модели термической травмы глаза. Данная модель, в отличие от химического повреждения, позволяет исключить возможную химическую нейтрализацию пептидов агрессивным химическим агентом.
Эксперимент проводили на 20 кроликах (40 глаз) породы Советская шиншилла весом от 2,5 до 3,2 кг. Все животные были разделены на опытную (10 кроликов, 20 глаз) и контрольную группы (10 кроликов, 20 глаз). В зависимости от центральной и парацентальной локализации ожога в каждой группе были сформированы две подгруппы по 5 кроликов (10 глаз) каждая. В опытной группе выполняли инстилляции в конъюнктивальную полость раствора пептидов по следующей схеме: 1-14 сутки – шестикратно в течение часа, 14-30 сутки – четырехкратно в течение часа. В группе контроля лечение термического ожога роговицы заключалось в четырехкратном в течение дня закапывании 0,5% раствора моксифлоксацина («Вигамокс») и четырехкратном закладывании геля «Солкосерил» за нижнее веко в течении 30 дней.
На 1-е сутки после нанесения термического ожога всем животным после инстилляции 0,5% раствора проксиметакаина под щелевой лампой HS (Haag-streit international) осуществляли скарификацию струпа роговицы.
Клинически на 1-е, 7-е, 14-е и 30-е сутки оценивали следующие признаки: наличие или отсутствие отделяемого, характер конъюнктивальной инъекции и ее выраженность, площадь дефекта роговицы (определялась после окрашивания 0,1% раствором флуоресцеина натрия), интенсивность помутнения роговицы (определялась с использованием «HR Typ 70900 Pentacam»), толщина роговицы (пахиметрия). В процессе выполнения каждого из этапов обследования выполнялась фоторегистрация посредством фотоаппарата «Canon EOS 70D», адаптированного к оптической системе щелевой лампы.
Перед получением экспериментальной модели термического ожога роговицы у экспериментальных животных выделяли стволовые клетки костного мозга, из которых в дальнейшем получали препарат пептидов.
Получение стволовых клеток из костного мозга
Для выделения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костный мозг получали из тазовой кости кроликов, находящихся под общим наркозом. Мононуклеарную фракцию клеток костного мозга выделяли на градиенте плотности с использованием стандартного раствора «Lympholyte-H» («Cedarlane», Canada). После получения суспензию мононуклеарных клеток высевали на чашки Петри и культивировали в среде DMEM c добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
Для подтверждения того, что используемые клетки обладают свойствами МСК, была проведена их остеогенная, хондрогенная и адипогенная дифференцировка по стандартной методике.
Получение пептидов
После получения клеточного монослоя проводили полную смену культуральной среды и через 3 суток кондиционированную культуральную среду объединяли с лизатом МСК. Культуру клеток разрушали, используя физико-химические методы. В результате чего получали препарат пептидов, представляющий собой прозрачную гомогенизированную жидкость малинового цвета.
Создание модели термической травмы роговицы
Термическое воздействие осуществляли после инстилляции в конъюнктивальную полость 0,5% раствора проксиметакаина по разработанной методике. Использовали специальное устройство с металлическим цилиндром с плоским основанием (диаметр основания 4,0 мм), подключенное к источнику переменного тока, максимальный пик температуры составлял 210°С. При моделировании ожога с повреждением лимбальной зоны наносилось 2 аппликата диаметром 4,0 мм каждый с перекрытием их на 1,0 мм. Сразу после термического воздействия всем кроликам за нижнее веко закладывали мазь 0,3% офлоксацин («Флоксал»).
Результаты
Во всех группах сразу после нанесения ожога оценить состояние роговицы и глубжележащих сред не представлялось возможным из-за наличия выраженного блефароспазма.
Исследование на модели центрального ожога роговицы
На 1-е сутки при скарификации в контрольной группе струп роговицы был более нежной консистенции в сравнении с опытной. В обеих группах наблюдалось значительное увеличение толщины роговицы за счет выраженного отека тканей и абсолютная непрозрачность исследуемого участка.
К 3-м суткам в опытной группе по краю дефекта отмечалась эпителизация и выраженные грануляции в центре пораженного участка. В контрольной группе после окрашивания дефекта было выявлено, что эпителизация началась не во всех краевых сегментах (ни у одного животного в наружном сегменте ее отмечено не было), грануляций в центре дефекта также не наблюдали.
На 7-е сутки в опытной группе дефект полностью эпителизировался, отека окружающих тканей не наблюдалось, в центре дефекта сохранялся участок истончения роговицы, о чем свидетельствовали данные «Pentacam», сохранялось нарушение светопроводящих свойств роговицы. В контрольной группе эпителизация дефекта была завершена у 4-х кроликов, выявлялось значительное снижение толщины роговицы в зоне ожога и выраженное нарушение светопроводимости по сравнению с опытной группой.
На 14-е сутки в опытной группе наблюдалось значительное улучшение светопроводящих свойств роговицы и приближение ее толщины к нормальным значениям. В группе контроля показатели толщины и светопроводимости были ниже.
На 30-е сутки в опытной группе прозрачность роговицы достигла нормальных значений, ее толщина восстановилась полностью, а данные пахиметрии перилимбальной области превышали исходные значения в среднем на 20 нМ. В группе контроля показатели прозрачности и толщины роговицы были ниже, чем в опытной.
Исследование модели периферического ожога роговицы
Исследование проводилось по тому же алгоритму, что и с моделью центрального ожога.
На 1-е сутки явных отличий между опытной и контрольной группой не наблюдалось.
На 3-и сутки у животных опытной группы отмечено начало развития эпителизации по краю дефекта, у животных группы контроля эпителизации не наблюдалось. По данным «Pentacam», в опытной группе толщина роговицы была выше на 10-30 нМ (в зависимости удаленности от поврежденного участка), чем в контрольной.
На 7-е сутки эпителизация в обеих группах была завершена. В опытной группе помутнение роговицы по площади значительно уменьшилось, на снимках «Pentacam» определялось перилимбальное истончение роговицы. В контрольной группе участок роговицы с термическим ожогом не был прозрачен, по лимбу наблюдалось разрастание сосудистой сети и гиперпигментация в пораженной области.
На 14-е сутки состояние глаз в опытной группе по результатам обследований приблизилось к исходному состоянию (до нанесения ожога). В контрольной группе наблюдалось прорастание новообразованных сосудов в толщу роговицы с сохраняющимся помутнением – васкуляризированное бельмо роговицы.
На 30-е сутки в опытной группе последствия термического ожога проявлялись в виде нежного стромального помутнения в центре термического воздействия (рис. 1).
В контрольной группе калибр проросших в роговицу сосудов увеличился, они все еще были полнокровными (рис. 2). Прозрачность роговицы улучшилась, однако не достигла исходных значений.
Заключение
Установлено, что при лечении термических ожогов роговицы раствором пептидов наблюдается снижение уровня воспалительной реакции, что проявляется в уменьшении отека, более быстром восстановлении поверхности роговицы и ингибировании неоваскулогенеза.
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности применения препарата раствора пептидов для лечения термических ожогов роговицы как с повреждением лимбальной ткани, так и без нее.
Необходимо проведение дальнейших исследований по оптимизации данной методики с различными концентрациями раствора пептидов, а также в комбинации с другими лекарственными средствами.
