Рис. 1. Местное применение ингибитора Rho-киназы Y27632 способствует более быстрому восстановлению ПЭК в модели криоповреждения роговицы у собак. А. – Репрезентативные изображения роговичного эндотелия, выполненные при помощи конфокальной микроскопии in vivo, демонстрирующие повреждение эндотелия (день 0) и его восстановление (день 28). Сразу после криоповреждения определяется обнаженная Десцеметова мембрана без признаков наличия эндотелиальных клеток. В течение первых 21 дней эндотелий роговицы не визуализировался в связи с выраженным отеком роговицы. Через 28 дней после криоповреждения после резорбции отека визуализируется восстановление монослоя эндотелия. Эндотелиальные клетки мелкие, имеют неправильную форму. В и С. – Анализ данных конфокальной микроскопии, подтверждающий, что через 28 и 42 дня после криоповреждения ПЭК была значительно выше в глазах на фоне терапии Y27632, чем PBS. В интактных нетравмированных глазах с течением времени ПЭК оставалась неизменной. Значения P определены при помощи теста Стьюдента, **P<0,01, *P<0,05
Рис. 2. Центральная толщина роговицы после местного применения ингибитора Rho-киназы Y27632 уменьшалась статистически значимо быстрее, чем в контрольной группе, в модели криоповреждения роговицы у собак. Значительное увеличение центральной толщины роговицы отмечалось сразу после криоповреждения роговицы в обеих группах, однако при местном применении Y27632 происходило статистически более значимое уменьшение центральной толщины роговицы в день 3, 4, 6 и 7 после вмешательства по сравнению с контролем. Значения P определены при помощи теста Холм-Сидака, ***P<0,001, *P<0,05 для Cryo+PBS vs Cryo+Y27632 групп
Rho представляет собой молекулярный переключатель, который отвечает за взаимодействие между рецепторами, связывающимися с протеином-G, и рецепторами клеточной поверхности, связывающи-мися с цитокинами, факторами роста и молекулами адгезии (Heasman S.J. et al.). Rho-киназа, связываясь с молекулой Rho, формирует комплекс, кото-рый регулирует множество физиологических функций, включая сокращение клеток, миграцию, пролиферацию, ангиогенез и хемотаксис (Riento K. et al.). Ингибирование
Rho-киназы стимулирует пролиферацию и адгезию эндотелиальных клеток in vitro и in vivo. В исследовании, проведенном Kinoshita S. et al., ингибитор Rho-киназы Y27632 увеличивал ПЭК в культуре эндотели-альных клеток и улучшал остроту зрения у людей с буллезной кератопатией. Ряд ингибиторов Rho-кина-зы при местном применении способствовали восстановлению прозрачности роговицы в моделях повреждения роговицы у животных и у людей (Okumura N. et al.).
Возможности трансплантации роговицы в мире ограничены по причине недостатка донорской ткани. Поэтому фармакологические разработки по стимуляции регенерации эндотелиальных клеток могли бы стать хорошей альтернативой хирургическому лечению. Исследования на животных являются необходимым этапом до проведения клинических исследований на людях. Цель данного исследования – описать ответ на местную терапию Y27632 после криоповреждения роговицы у собак.
Исследование проводилось в Калифорнии, США. Собакам, включенным в исследование, выполнялось офтальмологическое обследование до начала эксперимента, на 3, 7, 14, 21, 28, 42 и 56-й день после криоповреждения роговицы. Обследование включало тест Ширмера, фотографирование переднего отрезка глаза за щелевой лампой, определение чувствительности роговицы при помощи анестезиометрии, биомикроскопию и офтальмоскопию, ультразвуковую пахиметрию в различных точках роговицы, тонометрию, оптическую когерентную томографию с определением толщины роговицы, конфокальную микроскопию in vivo и окрашивание роговицы флуоресцеином.
Криоповреждение роговицы проводилось на правых глазах при сочетании общей и местной анестезии. Левые глаза оставались интактными. Стальным наконечником диаметром 8 мм, находившимся в жидком азоте в течение 3 минут при температуре около -196°С, прикасались к роговице в течение 20 секунд. В оба глаза собак закапывали Y27632, ингибитор Rho-киназы (n=3) или фосфатно-буферный раствор (PBS) (n=3) 6 раз в день в течение первых 7 дней после криоповреждения, затем 4 раза в день в течение оставшихся 49 дней. Для профилактики инфекционных осложнений собакам после вмешательства закапывали офлоксацин в течение 14 дней. Для уменьшения болевого синдрома в течение первых 7 дней собакам закапывали анальгетик.
В исследование были включены 6 собак женского пола породы гончая в возрасте 2,36±0,07 лет
Регенерация эндотелиальных клеток наблюдалась у всех собак к 28-му дню после криоповреждения роговицы (рис. 1 А).До 21 дня после вмешательства визуализация эндотелиальных клеток была затруднена в связи с отеком роговицы. С 28 до 56-й день после криоповреждения в центральной части роговицы визуализировались маленькие неправильной формы эндотелиальные клетки. ПЭК была значительно выше на правых глазах собак, получавших лечение Y27632, по сравнению с левыми глазами, получавшими лечение PBS в день 28 (P=0,024) и в день 42 (P=0,037) (рис. 1 В).Применение Y27632 не влияло на ПЭК левых глаз (рис. 1 С).
Криоповреждение роговицы вызывало значительный отек и увеличение центральной толщины роговицы у собак. Прозрачность роговицы во всех случаях восстанавливалась к концу 4-й недели. По данным ОСТ и ультразвуковой пахиметрии Y27632 способствовал значительному уменьшению толщины роговицы в острую фазу(рис. 2, 3). ВГД в группе Y27632 было ниже, чем в группе PBS, через 3, 7 и 10 дней после вмешательства, однако в остальные промежутки времени статистически значимых различий между группами выявлено не было.
В литературе имеются сообщения об эффективности ингибиторов Rho-киназы у людей после криотравм (Okumura N. et al.), после выполнения изолированного десцеметорексиса без эндотелиальной кератопластики (Moloney G. et al.) и в комбинации с терапией эндотелиальными клетками (Kinoshita S. et al.).
Криовоздействие на роговицу является стандартной техникой экспериментального повреждения эндотелия роговицы (Okumura N. et al., Strom A.R. et al., Thomasy S.M. et al.). Поведение эндотелиальных клеток роговицы человека в наибольшей степени совпадает с клетками приматов, однако эксперименты с приматами довольно дороги. Способность к пролиферации эндотелиальных клеток кроликов выше, чем у человека, поэтому экспериментальные исследования на кроликах могут приводить к неверным заключениям (Minkowski J.S. et al.). В то же время морфология эндотелия и его способность к восстановлению у собак почти идентична приматам (Shull O.R. et al.). Авторы считают, что модель криоповреждения роговицы у собак может служить полезной альтернативой экспериментам на приматах при изучении регенерации эндотелиальных клеток.
По результатам данного исследования при помощи ОСТ переднего отрезка глаза и конфокальной микроскопии было выявлено более быстрое восстановление роговицы на фоне применения Y26732 по сравнению с контролем.
Hidetaka Miyagi, Soohyun Kim, Jennifer Li, Christopher J. Murphy, Sara M. Thomasy. Topical Rho-associated kinase inhibitor, Y27632, accelerates corneal endothelial regeneration in a canine cryoinjury model. Cornea. 2019;38(3): 352–359.
