Рис. 1. Культура эпителиоидоцитов, выделенных из лимбальной зоны трупного донорского глаза: а) первичная культура клеток, 4 сутки культивирования; б) культура клеток после 3 пассажа, 18 сутки культивирования. Фазово-контрастная микроскопия
Рис. 2. Первичная культура эпителиоидоцитов: а) экспрессия фибронектина (зеленый); б) экспрессия кератансульфата (красный). Иммуноцитохимическое окрашивание, докраска ядер Hoechst 33258 (синий)
По мнению ряда исследователей, с помощью биоинженерных конструкций искусственной роговицы представляется возможным добиться не только прозрачности, заданной рефракции и восстановления предметного зрения, но также исключить риск переноса опасных инфекций от донора реципиенту, нивелировать риск развития реакции отторжения, а также свести к минимуму иммуносупрессивную терапию [8].
На сегодня клеточная биология и регенеративная медицина развиваются по ряду перспективных направлений, к которым следует отнести следующие:
- клеточная терапия путем введения в организм суспензии стволовых и (или) дифференцированных специализированных клеток [13];
- трансплантация биоинженерных клеточно-тканевых конструкций, созданных на основе трехмерной (3D) биополимерной матрицы и функционально дифференцированных клеток, для полной или частичной компенсации поврежденных тканей и органов и восстановления их специфических функций [17];
- трансляционная медицина как способ персонализированного введения аутогенных стволовых клеток для индукции морфогенеза и физиологической регенерации непосредственно в тканях и органах самого пациента [1, 2, 12];
- трансплантация 3D-организованных мини-тканей (тканевых сфероидов) [5, 6].
Глазное яблоко — сложная многокомпонентная тканевая структура, образованная в эмбриогенезе клетками разных зародышевых листков: покровной эктодермой, нейроэктодермой, нервным гребнем и мезенхимой и, в этой связи, может служить источником стволовых прогениторных клеток для создания 3D-клеточно-тканевых конструкций. В свою очередь при использовании 2D-клеточных технологий в процессе пассирования высокоочищенных клеток имеют место проблемы возникновения аномалий фенотипа, кариотипа, гетерогенности морфо-функциональных признаков in vitro, а также возникает существенная проблема взаимодействия и адгезии дифференцированных клеток с экстрацеллюлярным (биополимерным) матриксом. Полагают, что это может быть связано с доминированием специфических сигналов клеточного микроокружения и их механобиологических особенностей в плоскостной культуре [15].
Рис. 3. Стромальные клетки лимбальной зоны, выделенные из трупного донорского глаза: а) первичная культура клеток, 3 сутки культивирования; б) культура клеток после 3 пассажа, 15 сутки культивирования. Фазово-контрастная микроскопия
Рис. 4. Культура стромальных клеток лимба, 3 пассаж (15 сутки культивирования), экспрессия альфа-актинина (зеленый). Иммуноцитохимическое окрашивание, докраска ядер Hoechst 33258 (синий)
Таким образом, фундаментальное изучение феномена образования клеточных сфероидов и прикладное создание 3D-биоинженерных конструкций искусственных роговиц на основе сфероидных технологий представляется наиболее перспективным и актуальным направлением современной офтальмологии и регенеративной медицины.
Цель
На основе знаний в области современных клеточных технологий изучить принципиальную возможность использования культивированных сфероидов из различных клеточных источников лимбальной зоны глазного яблока для создания биоинженерной 3D-конструкции искусственной роговицы.
Материал и методы
Для исследования нами взяты 12 донорских глаза от 6 трупов доноров в возрасте от 21 до 37 лет, время от момента констатации биологической смерти до выделения тканевых фрагментов — от 6 до 12 часов. Для исследования были отобраны 48 образцов тканей лимбальной зоны глазного яблока.
Монослойные культуры и 3D-сфероиды получали из стромальных и эпителиоидных клеток лимбальной зоны глазного яблока. Изолированные кусочки лимба переносили в 100 мм чашки Петри в раствор Хенкса с антибиотиками (ПанЭко, Россия), тщательно отмывали, механически измельчали с помощью ножниц и ферментативно диссоциировали в 0,25%-ном растворе трипсина (ПанЭко, Россия). После фильтрации клетки центрифугировали (8 мин., g=100 см2/с) и высевали в пластиковые чашки Петри в высокой плотности (100 000 кл./мл) в среду DМЕМ/F12 (1:1, ПанЭко, Россия) с добавлением глютамина (2 мМ/L, ПанЭко, Россия), гентамицина (50 мкг/мл, ПанЭко, Россия), ИТС (1:100) (инсулин, трансферин, селенит, ПанЭко, Россия) и 10%-ной сыворотки эмбрионов коров (HyClone, США). Культивировали в СО2-инкубаторе при 5% СО2 и 37°C со сменой среды каждые 2-3 дня. На 7-10 сутки инкубирования проводили пассирование культур. Фенотип полученных клеточных культур изучали с помощью проточной цитофлуориметрии и флуоресцентных моноклональных антител (Beckman Coulter, США) согласно стандартным протоколам. Для получения 3D-сфероидов клетки после 1-2 пассажей снимали с подложки с помощью 0,25%-ного раствора трипсина (ПанЭко, Россия) и культивировали в системе «висячая капля» в плотности 30 000 кл/мл в течение 6-7 дней в стандартных условиях (5% СО2, 37°C), используя полную ростовую среду [5]. Для серийного получения 3D-сфероидов применяли 3D-культивирование в неадгезивных 256-луночных агарозных планшетах (3D Petri Dishes, Microtissue, США). Концентрацию клеток 27000-30000 кл./мл выбирали, исходя из диаметра, числа лунок и желаемой плотности сфероидов. Часть полученных клеточных сфероидов фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида (Sigma, США) для дальнейшего иммуногистохимического анализа и 1,5%-ным раствором глютарового альдегида (Sigma, США) для изготовления полутонких срезов. Фиксированные в параформальдегиде (Sigma, США) сфероиды замораживали в среде для криотомирования (Leica, Германия) и производили серию срезов толщиной 10 мкм. Срезы помещали на полилизиновые предметные стекла, трижды промывали фосфатно-солевым раствором (рН=7,4, ПанЭко, Россия), затем проводили иммуноцитохимический анализ на экспрессию следующих маркеров: нестин (Chemicon, Франция), виментин (Sigma, США), цитокератин 19 (Abcam, Великобритания), коллагены I и V типов (Abcam, Великобритания), альфа-актинин (Abcam, Великобритания), ламинин (Abcam, Великобритания), фибронектин (Abcam, Великобритания), кератокан (Thermo Scientific, США) и кератансульфат (Thermo Scientific, США). Окрашивание срезов производили в условиях влажной камеры при комнатной температуре по протоколам, предлагаемыми производителями. Сфероиды, фиксированные в глютаровом альдегиде, дофиксировали OsO4 (1%-ный водный раствор, 1-2 часа) (Sigma, США). Далее обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в эпоксидную смолу аралдит (Sigma, США), и на ультратоме получали полутонкие срезы.
Результаты оценивали при помощи фазово-контрастной, люминесцентной, сканирующей электронной и лазерной конфокальной микроскопии, а также анализировали на проточном цитофлуориметре FC500 (Beckman Coulter, США) с помощью программы BD FACSDiva.
Результаты и обсуждение
Изначально при выделении культура эпителиоидных клеток лимба контаминировалась другими типами клеток (стромальными, фибробластоподобными), что технически осложняло выделение чистой гомогенной популяции эпителиоидоцитов. При монослойном (2D) культивировании эпителиоидоциты сохраняли эпителиальный фенотип только в первые дни культивирования (рис. 1а), а при дальнейшем пассировании (2ой- 4ый пассажи) и монослойном культивировании в полной ростовой среде эпителиоидоциты приобретали фибробластоподобный фенотип (рис. 1б) и экспрессировали маркеры, характерные для мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Анализ культуры эпителиоидоцитов методом проточной цитофлуориметрии после 2 и 4 пассажей показал, что доля CD90+ клеток увеличивалась с 58 до 95%, CD105+ клеток — с 70 до 99%, CD29+ клеток — с 90 до 99% от общего количества клеток в культуре. Доля CD34+ клеток варьировала в пределах 1,5-3%, CD45+ — 4-6%, CD14+ — 0,8-1%, CD19+ — 0,6-0,8%, CD11b+ — 1-2%.
Рис. 5. 3D-сфероиды из стромальных клеток лимба: а) 3 сутки культивирования; б) 10 сутки культивирования. Сканирующая электронная микроскопия
Рис. 6. 3D-сфероид из стромальных клеток лимба (7 сутки культивирования), экспрессия коллагена I типа. Иммуноцитохимическое окрашивание. Сканирующая лазерная конфокальная микроскопия
Первичная культура стромальных клеток лимбальной зоны была гетерогенной и содержала несколько типов клеток: стромальные, фибробластоподобные, мезенхимоподобные и в небольшом количестве ангиопрогениторные клетки (рис. 3а). При дальнейшем 2D-культивировании на полной ростовой среде в культуре возрастало количество мезенхимоподобных клеток, экспрессирующих CD90 (с 80 до 95% от общего количества клеток в культуре), CD105 (с 90 до 98%) и не экспрессирующих CD45, CD34, CD14, CD19, CD11b (рис. 3б). Также увеличивалось количество клеток, экспрессирующих альфа-актинин (до 80%) — маркер, характерный для мезенхимальных клеток (рис. 4).
Помещая первичные диссоциированные суспензии 2D-культивированных клеточных культур эпителиоидоцитов и стромальных клеток лимба в условия 3D-культивирования (систему «висячей капли»), в полной ростовой среде получали 3D-сфероиды. При этом было установлено, что диссоциированные стромальные клетки лимба и эпителиоидоциты в одинаковых условиях 3D-культивирования имели сравнимую временную и количественную динамику формирования сфероидов. В 3D-культуре уже в первые часы инкубирования клетки объединялись в рыхлые агрегаты, которые через 1-3 суток формировали сфероиды с гладким поверхностным клеточным слоем (рис. 5а). При дальнейшем культивировании плотность сформированных сфероидов возрастала (рис. 5б). При культивировании в системе «висячая капля» и культивировании на агарозных планшетах 3D Petri Dishes временная и количественная динамика формирования сфероидов, а также морфологические характеристики сформированных сфероидов не отличались.
Проведенные иммуногистохимические и морфофункциональные исследования сфероидов из стромальных клеток лимба выявили их эпителио-мезенхимальную пластичность, лежащую в основе образования сфероидов. Поверхностные клетки сформировавшихся сфероидов приобретали эпителиальный фенотип и активно экспрессировали нестин и цитокератин 19 вместе с компонентами базальной мембраны — ламинином, фибронектином и коллагеном I типа (рис. 6).
С нашей точки зрения, экспрессия белков базальной мембраны играла не последнюю роль в процессе формирования сфероидов и в поддержании функциональности клеточных культур. Кроме того, было выявлено значительное увеличение экспрессии коллагенов I и V типа и фибронектина в сфероидах, как на поверхности, так и в центральной части в то время, как в 2D-культуре наблюдалось снижение экспрессии указанных белков.
Из литературы известно, что внеклеточный матрикс (ВКМ) формирует микроокружение клеток и представляет собой динамичный и сложный комплекс гликопротеинов, протеогликанов, гликозаминогликанов и коллагена [11]. In vivo ВКМ формирует объем, форму и прочность многих тканей, например, базальной мембраны, фиброзных капсул, костной и хрящевой тканей. In vitro ВКМ обеспечивает миграцию и адгезию клеток большинства культур. Однако функции ВКМ заключаются не только в механической и структурной поддержке, но и во влиянии на развитие сигнальных путей, формировании стволовых ниш и морфогенеза. ВКМ создает пространственный контекст для взаимодействия сигнальных молекул и их рецепторов, а также молекул адгезии — интегринов. За счет изменения своих физических характеристик — эластичности, плотности и механического напряжения на поверхности — ВКМ может открывать и скрывать сайты взаимодействия с факторами роста и их рецепторами, влияя, таким образом, на дифференцировку и функциональное состояние клеток. Таким образом, изменяя состав ВКМ, можно задавать поведение клеток, их полярность, направлять миграцию и дифференцировку, запускать пролиферацию и апоптоз.
В сфероидах из кератоцитов, кроме экспрессии фибронектина, коллагенов I и V типов, мы наблюдали экспрессию кератокана и кератансульфата — гликозаминогликанов, экспрессирующихся in vivo кератоцитами и играющих ключевую роль в обеспечении и поддержании прозрачности роговицы (рис. 7а, 7б). Следует также отметить, что эпителиоидоциты в процессе развития также секретировали коллагеновые волокна I типа и фибронектин. Электронно-микроскопическое исследование выявило не хаотичное, а направленное параллельное друг другу и продольное (вдоль клеток) расположение коллагеновых фибрилл в сфероидах из эпителиоидоцитов. Такое расположение волокон соответствует архитектонике коллагеновых фибрилл в строме нативной роговой оболочки глазного яблока.
В отличие от 3D-сфероидов при культивировании в монослое эпителиоидоцитов уже после 1-го пассажа происходило изменение морфологических и фенотипических свойств клеток. При этом клетки не экспрессировали коллагены I и V типов либо выделяли их в ничтожно малом количестве, а экспрессия важных для роговицы гликозаминогликанов — кератокана и кератансульфата — полностью исчезала.
Ранее использованные нами биополимерные матрицы, будучи не токсичными и не аллергенными, достаточно эффективно заселялись хорошо пролиферирующими и мигрирующими клетками, формировавшими правильную трехмерную структуру искусственной роговицы [5]. Однако их использование в клинике для создания биоинженерных конструкций искусственной роговицы нам представилось не целесообразным в связи с тем, что со временем такая конструкция полностью теряла свою прозрачность. Полагаем, что с помощью технологии образования сфероидов представляется возможным длительно и полноценно сохранять функциональные свойства специализированных клеток роговицы.
Заключение
Результаты первых исследований показали принципиальную возможность использования 3D-культивированных сфероидов из стромальных и эпителиоидных клеток лимбальной зоны как основы 3D-организованных мини-тканей для конструирования искусственной роговицы. Данная технология позволяет длительно и полноценно сохранять функциональные свойства специализированных клеток роговицы и отказаться от использования биополимерных матриксов в 3D-конструкциях искусственной роговицы.
