Таблица 1 Клинические формы ЭОП и степень их компенсации
Таблица 2 Распределение уровней экспрессии микроРНК-146a и микроРНК-155 в основной и контрольной группах
Избирательное поражение мягких тканей орбиты лежит в основе формирования 3 клинических форм ЭОП: тиреотоксического псевдоэкзофтальма, отечного экзофтальма (ОЭ) и эндокринной миопатии. Наиболее тяжело протекает ОЭ, который может сопровождаться как нарушением зрительных функций, так и серьезными косметическими недостатками. Такие больные составляют 5-7% среди всех больных ЭОП. Зоной первичного поражения могут быть прямые мышцы глаза (миогенный вариант ОЭ) и орбитальная клетчатка (липогенный вариант ОЭ), но чаще все же диагностируется смешанный вариант заболевания [2].
С 50-х годов XX столетия единственно эффективным методом лечения остаются глюкокортикоиды (ГК). Однако 5-30% больных не отвечают на лечение ГК [3, 4]. Столь значительную вариабельность показателей резистентности к ГК можно объяснить как особенностями патогенеза, так и некорректным их назначением. Причины наличия глюкокортикоидорезистентности у больных ЭОП до настоящего времени остаются дискутабельными. При аутоиммунных заболеваниях одной из причин неэффективного действия ГК считают наличие полиморфизма генов ГК рецептора NR3C1 и ферментов, участвующих в их метаболизме [5-7]. Это положение по характеру заболевания может быть распространено и на ЭОП. Публикации по данному вопросу, однако, единичны и противоречивы [5, 8]. В частности, проведенное фармакогенетическое тестирование по полиморфизму генов NR3C1, CYP3A5, CYP3A4 не подтвердило связь полиморфных вариантов гена ГК рецептора NR3C1 и цитохрома Р450 с ГК ответом у больных ЭОП [9].
В последнее время в литературе появляются сведения, указывающие на роль эпигенетических механизмов в развитии ряда аутоиммунных заболеваний, не исключением явилась и ЭОП. Речь идет о микроРНК, которые рассматривают в качестве потенциальных биомаркеров развития ЭОП и отрицательного ответа на терапии ГК у этой группы больных [10, 11]. Считают, что микроРНК задействованы в сложных механизмах патогенеза и его контроля при различных заболеваниях. Влияя на степень экспрессии генов, они участвуют в процессах клеточной пролиферации, дифференцировки клеток и апоптоза [12]. Наибольшую роль в тяжести течения ЭОП можно отнести к функциям микроРНК-21, микроРНК-27a, микроРНК-27b, микроРНК-146a, микроРНК-155 [13-15]. Тем не менее, роль микроРНК в патогенезе ЭОП полностью не определена.
Показана роль микроРНК в регуляции адипогенеза [13]. Авторы исследовали значимость микроРНК-27a и микроРНК-27b в адипогенезе ретробульбарной клетчатки у больных ЭОП in vitro и контрольной группы. В результате было получено достоверное снижение уровней экспрессии семейства микроРНК-27 (27a и 27b) в орбитальной жировой клетчатке у больных ЭОП по сравнению со здоровыми лицами. Что же касается микроРНК-21, то снижение уровня ее экспрессии приводило к подавлению пролиферации и дифференцировки орбитальных фибробластов и усилению апоптоза. Повышенная их экспрессия, наоборот, усиливала пролиферацию и дифференцировку орбитальных фибробластов, блокируя их гибель [14]. Это дает основание полагать, что микроРНК-21 принимают участие в пролиферации фибробластов с последующим быстрым развитием фиброза пораженных тканей.
Участие в адипогенезе и избыточном образовании фибробластов принимают и другие микроРНК. Речь идет о микроРНК-146а и микроРНК-155, которые, как полагают, отвечают за пролиферацию миофибробластов и развитие фиброза в мягких тканях орбиты [15, 16]. Однако все не так однозначно. МикроРНК-146a принимают участие в патогенезе ЭОП, оказывая противовоспалительный и антифиброзный эффекты [16]. В то же время, выявлено, что повышенная экспрессия микроРНК-146a способствует воспалению и прогрессированию этого заболевания, увеличивая митоз фибробластов [17]. И микроРНК-146a, и микроРНК-155 характеризуются противоположным влиянием на воспалительные реакции, осуществляемые Т-лимфоцитами и, по-видимому, имеют несколько мишеней в патогенезе ЭОП [18].
Цель
Изучить роль микроРНК-155 и микроРНК-146a у больных разными клиническими формами ЭОП и их влияние на ГК ответ.
Материал и методы
В группу исследования вошли 20 больных (40 орбит) ЭОП, резистентных к ГК. Средний возраст их составил 52,65±12,6 года. Контрольную группу составили 28 волонтеров в возрасте 62,9±7,54 лет, не имеющих аутоиммунных и опухолевых заболеваний. Клинические формы ЭОП представлены в таблице 1.
Таким образом, в исследование вошли равноценные по количеству группы пациентов с активной стадией ЭОП и в стадии ее компенсации. Диагноз ЭОП и ее клинической формы базировался на основании анализа длительности (важно!) анамнеза заболевания, данных офтальмологического обследования, УЗ-сканирования и эхобиометрии ЭОМ, компьютерной томографии (КТ) орбит. Оценку уровня экспрессии микроРНК-155 и микроРНК-146a определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с использованием прибора CFX96 Real -Time PCR Detection System (Bio-Rad, США).
Статистический анализ для выборок малого объема проводили с использованием непараметрического статистического критерия Манна–Уитни с помощью программы Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США).
Результаты и обсуждение
Распределение уровней экспрессии микроРНК-146a и микроРНК-155 в основной и контрольной группах представлено в таблице 2.
Оказалось, что различия в распределении уровней экспрессии микроРНК-146 и микроРНК-155 в основной и контрольной группах статистически значимы (p<0,01). Уровень экспрессии микроРНК-146а в целом по группе больных ЭОП в 21,8 раза превышает уровень микроРНК-146а контрольной группы. А микроРНК-155 этих же больных превышает уровень контрольной группы в 1,7 раза. Полученные результаты подтверждают, что повышенная экспрессия микроРНК-146a и микроРНК-155 в плазме крови больных ЭОП способствует избыточной пролиферации фибробластов, быстрому развитию фиброза содержимого орбиты, являясь вероятной причиной резистентности к ГК у больных ЭОП.
В таблице 3 представлены уровни экспрессии микроРНК-146а и микроРНК-155 в плазме крови больных разными клиническими формами ЭОП, резистентных к ГК.
МикроРНК-146а и микроРНК-155 - многофункциональные гены, они могут работать как в качестве активаторов клеточной пролиферации, так и апоптоза. Результаты исследования показали, что более активная экспрессия отмечена у больных с липогенным вариантом ОЭ (превышение уровня экспрессии в 57,89 раз по сравнению с контрольной группой). Такое же значительное превышение отмечено и у больных эндокринной миопатией, имеющих длительный анамнез заболевания (уровень экспрессии микроРНК-146а больше в 26,51 раза по сравнению с контрольной группой).
В группе больных с миогенным и смешанным вариантом ОЭ уровень экспрессии микроРНК-146а превышал всего в 8,5 раз. Учитывая патоморфологические изменения, обнаруживаемые у больных этих групп (фибротизация), можно сделать заключение, что повышенный уровень орбитальных фибробластов связан с активацией микроРНК-146а. По мнению N. Wanget et al, действие микроРНК-146а у больных ЭОП сложное. Они могут выполнять различные функции в орбитальных фибробластах: активизировать пролиферацию клеток и подавлять ее [17]. МикроРНК-155 у больных тех же групп имели аналогичную закономерность. Так, у больных липогенным ОЭ и эндокринной миопатией с компенсированным клиническими симптомами уровень экспрессии микроРНК-155 был повышен соответственно в 2,5 и 2,3 раза, а пациенты с миогенным и смешанным вариантом заболевания имели уровень превышения экспрессии всего в 1,77 раза. Показатели меньше, чем при микроРНК-146а, но закономерность распределения та же. Это связано с тем, что микроРНК-155 тоже многофункциональные гены с характерной регуляцией, но условия меняют их функции. Они могут регулировать пролиферацию клеток, их дифференцировку или усиливать апоптоз [18].
Заключение
Полученные результаты функциональной активности микроРНК-146а и микроРНК-155 подтверждают их участие в патогенезе развития отечного экзофтальма и эндокринной миопатии путем активизации фибропластического процесса. Есть основание полагать, что именно эта особенность и приводит к формированию отрицательного глюкокортикоидного ответа у таких больных.
