Многофакторный анализ патогенеза ранних прогрессирующих стадий ретинопатии недоношенных

    

    Актуальность

    Ретинопатия недоношенных (РН) является вазопролиферативным заболеванием, приводящим к инвалидности по зрению (1–6).

    Цель

    Выявитьзначимые факторы, участвующие в патогенезе ретинопатии недоношенных.

    Материал и методы

    Всего в процессе организации службы по выявлению и лечению РН обследовано и пролечено1254 больных (2508 глаз). На введение анти VEGF-препаратов (луцентис или эйлеа) в условиях операционной и лазеркоагуляцию сетчатки было направлено 163 больных (326 глаз). Исследование крови было проведено у 192 детей (384 глаза). Изложение материала последует по ходу поставленных задач. Был проведен мультивариационный статистический анализ, детали описаны в каждой задаче.

    Задача 1. Изучить лабораторные показатели крови у детей с прогрессирующими стадиями ретинопатии недоношенных.

    Материал и методы. В исследование включено 17 детей с ретинопатией недоношенных в стадии III–IV (медиана возраста 5 месяцев, возраст гестации 27 недель), 5 детей с риском ретинопатии (медиана возраста 3 месяца, возраст гестации 27 недель), а также в качестве двух контрольных групп: 5 доношенных новорожденных с инфекционными осложнениями вне зрительного аппарата (медиана 18 дней, возраст гестации>39 недель) и 5 детей с гемангиомой (медиана возраста 3 месяца, возраст гестации 33,5 недель). Нами исследованы следующие показатели крови: гемоглобин, количество тромбоцитов, гематокрит, количество лейкоцитов, билирубин общий, лактат, С-реактивный белок, глюкоза; АЧТВ, ТВ, ПИ и концентрация фибриногена (регистратор «Тромбодинамика»). Для расчета статистически значимых изменений между группами использован тест Манна–Уитни с уровнем значимости Р<0,05.

    Результаты исследования (рис. 1–3)

    Результаты

    У недоношенных детей с ретинопатией, независимо от стадии заболевания, наблюдается снижение гемоглобина (в среднем 116 ± 18 г/л), в то время как у доношенных детей гемоглобин в норме, несмотря на течение септического процесса (в среднем 149± 32 г/л). Показатели тромбоцитов в норме у детей с РН и сравнимы с данными контрольных групп. Повышение лейкоцитов наблюдает у 2 пациентов с РН и риском РН, а также у большинства пациентов с воспалением. Повышение также связано с воспалительными процессами при РН. У недоношенных пациентов с РН повышен лактат, что может свидетельствовать о лактацидозе (в среднем 3,1 ± 1,9 мМоль/л норма до 1,6 мМоль/л), который может развиваться у глубоко недоношенных. Лактат также повышен у недоношенных детей с гемангиомами (в среднем 1,9 ± 0,1 мМоль/л). Повышен также билирубин (p < 0,01) у доношенных детей с инфекционными заболеваниями. С точки зрения системы гемостаза при РН значимо изменены показатели тромбинового времени, а также концентрации фибриногена по сравнению с контрольными группами (в среднем ТВ = 25,9 ± 3,3 секунды, фибриноген 1,9 ± 0,8 г/л при РН и ТВ = 18,9 ± 1,5 сек, фибриноген 2,6 ± 0,6 г/л в контрольной группе с гемангиомой).

    Заключение к задаче 1. Ретинопатия недоношенных – это сложное заболевание, при котором пациенты страдают от порока развития сетчатки глаза. Наше исследование показало, что большое количество лабораторных показателей, биохимии, электролитов, гемоглобин и показатели гемостаза изменены у детей с ретинопатией недоношенных по сравнению с недоношенными пациентами с гемангиомой и доношенными детьми с течение инфекционного процесса. Нельзя забывать, что все эти показатели в том числе влияют на исход осложнений после проведенного оперативного вмешательства по поводу РН, и в том числе могут оказывать прямо влияние на такие осложнения как отек, гемофтальм, рефракционная ошибка. Разумеется, оперативного вмешательства требует в том числе применение наркоза, что также связанно с необходимостью оценки лабораторных показателей состояния пациента. У пациентов с более тяжелой стадией РН, с меньшим весом, более выражены изменения в показателях гемоглобина, тромбинового времени, лактата, чем у пациентов с риском РН.

    Задача 2. Изучение количества Т-регуляторных клеток CD4+CD25highFoxp3+ CD127low (Т-рег) у больных с ранними прогрессирующими стадиями ретинопатии недоношенных.

    Материал и методы. Всего было обследовано 106 детей (212 глаза) в возрасте до 1 года. Из них 79 детей (158 глаз) детей с ретинопатией недоношенных, и 27 здоровых доношенных детей (54 глаза) того же возраста. Детям были произведены стандартное офтальмологическоеобследование. Произведено иммунофенотипирование Т-регуляторных клеток CD4+CD25highFoxp3+CD127 low. При статистической обработке полученных результатов использовался критетий Стьюдента (программа Statisnica 7) и модуля «Вероятностный колькулятор».

    Результаты исследования представлены на рис. 4, 5.

    При построении полиноминальной линии тренда с учетом здоровых доношенных детей R2 приближается к 0,7 (рис. 4), без учета здоровых доношенных детей R2 приближается к 1,0 (располагается по ходу графика).

    Как показано на рис. 5, отмечается статистически достоверное различие (p < 0,03) при сравнении всех детей с разной степенью активности ретинопатии недоношенных и доношенных здоровых детей.

    Заключение к задаче 2. При обследовании детей до 1 года были обнаружены существенные различия по количеству Т-рег CD4+CD25 highFoxp3+CD127low между доношенными и недоношенными детьми с различной активностью процесса (самые низкие уровни обнаруживались при прогрессирующих 1 и 2-й стадиях РН), выделена в отдельную форму ЗАРН, протекающую с повышенными или формально нормальными уровнями Т-рег.
    Задача 3. Выявление VEGFА165 и его рецептора VEGFА165R1 в крови у детей с РН и катарактой.

    Материал и методы. Исследование произведено у 19 детей методом ПЦР, из них у 13 больных ранними прогрессирующими стадиями РН, у 6 – с врожденной катарактой (программа Statistica 7).

    Результаты исследования. На рис. 6а, б представлены результаты выявления VEGFА165 и VEGFA165R1 в крови у детей с РН и врожденной катарактой.

    Заключение к задаче 3.Как показано на рис. 6а, б, высокие уровни экспрессии гена VEGFА165(> 50,0) и VEGFA165R1(> 50,0) в крови детей с РН значительно превышают уровни этого фактора роста у больных детей с катарактой (р < 0,01).

    Задача 4. Провести анализ известных про- и антиангиогенных факторов, усиливающих или ослабляющих развитие сосудов сетчатки новорожденных – молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза РН.

    Материал и методы. В анализ были отобраны 16 (шестнадцать) пациентов (8 женщин, 8 мужчин) с 3 ± 5 стадиями ретинопатии недоношенных. Возраст пациентов составлял от 1 месяца до 12,5 лет (10 детей в возрасте до 1 года). Детям проводилась лазеркоагуляция и интравитреальное хирургическое вмешательство в зависимости от стадии, распространенности и активности процесса. Были проанализированы данные полноэкзомного секвенирования по методу, описанному ранее [4].

    Результаты исследования. На основе анализа данных литературы, базы данных экспрессии белков UniProt, а также на основе собственных данных для изучения экспрессии были отобраны 19 проангиогенных(VEZF1, LTF, CSF1R, EGR1, FGF1, PTN, IFITM, HSP90AB1, HSP90B1, PRDX1, JMJD, ACTA2, XBP1, CCNG1, S100A10, IRS2, UPP1, MGP, OLFML3) и 19 антиангиогенных генов (RHBDF1, CTNNA1, F11R, PSEN2, RHBDF1, PLG, COL18A1, VHL1, EIF4A1, EIFH4, ANKRD23, MIR-16, RAB6B, TSP1, RACK1, NR2E3, TKT, VLDLR, IGFBP4).

    Заключение к задаче 4. Итак, выявлены про- и антиангиогенныефакторы, участвующие в патогенезе РН.

    Задача 5. Исследование сыворотки крови детей с ретинопатией недоношенных при помощи метода мультисенсорной инверсионной вольтамперометрии.

    Материал и методы. Была обследована сыворотка крови детей с ретинопатией недоношенных (РН) (5 детей с риском развития РН, 4 ребенка с I активной стадией РН, 5 детей с III+ стадией РН) и в качестве группы сравнения 5 доношенных детей со сроком гестации от 38 до 40 недель того же возраста в весе от 3 до 4 кг и с подобными недоношенным соматическими заболеваниями. Стадия РН определялась по худшему глазу. Забор сыворотки крови производился в операционной во время введения ребенка в наркоз.

    Недоношенные дети имели в анамнезе перинатальное поражение центральной нервной системы II–III степени, анемию недоношенных, внутриутробную пневмонию с дыхательной недостаточностью 1–3 степени, ишемическое поражение перивентрикулярной области, внутрижелудочковые кровоизлияния II–III степени, некротизирующий энтероколит, изменение гемодинамики в связи с пороками развития сердечно-сосудистой системы. Выхаживание этих детей происходило с использованием кислорода от нескольких суток до 1 месяца, в единичных случаях –дольше.

    Метод мультисенсорной инверсионной вольтамперометрии.На планарные электроды фирмы «Автоком» наносили 50 мкл тест-системы, состоящей из 0,05 М КС1, в котором находились катионы металлов Zn2+, Cd2+, РЬ2+, Сu2+, Hg2+ в концентрации 5•10-5М, затем снимали инверсионную вольтамперограмму при потенциале катодного осаждения металлов минус 1,55В относительно хлорсеребряного электрода с последующей разверткой в анодную сторону до потенциала до 0,3 В. Полученная вольтамперограмма являлась фоновой. Затем на электрод помещали 50 мкл тест-системы и 5мк сыворотки крови

    Результаты исследования представлены на рис. 7, 8.

    Проведенный анализ различий средних значений пиков растворения металлов (ППП Statistica) между группами выявил значимое различие (р < 0,05) для всех металлов, кроме: Cd в группах РН I и риск РН р > 0,05 и Hg– между теми же группами р > 0,05. Погрешность задания-измерения потенциала–0,5 %; погрешность измерения тока –0,5 %.

    Заключение к задаче 5. Показано, что действие сыворотки крови недоношенных и доношенных детей разных стадий достоверно различаются по высоте пиков токов на введение Hg (p < 0,01). Cо стадией РНIII+ на пики токов Cd и Pb меньше, чем сыворотки крови недоношенных с риском РН, а также недоношенных со стадией РНI и доношенных без ретинопатии. Показано, что действие сыворотки крови недоношенных со стадией РНI на на пики токов Cd и Pb больше, чем сыворотки крови недоношенных c риском РН и сыворотки крови доношенных без РН; однако действие сыворотки крови доношенных без ретинопатии меньше, чем действие сыворотки крови недоношенных со стадией РНI. Показано, что данные всех групп достоверно различаются между собой (p <0,05; Statistica 6).

    Вывод

    У детей с ранними прогрессирующими стадиями ретинопатии недоношенных выявлены изменения в различных звеньях гомеостаза по сравнению с доношенными соматически здоровыми детьми.