Рис. 1. Концентрическое дозированное удаление ростковой зоны лимба. А – нанесение насечки лезвием с дозированной микроподачей. Б – удаление ленты лимба с роговичной и конъюнктивальной тканью
Рис. 2. Изменения в роговице и эпителизация на 3-й, 7-й, 14й, 30-й день после операции. Пояснения в тексте
Дисфункция ЛЭСК клинически проявляется состоянием, получившим название лимбальной недостаточности (ЛН). ЛН может развиваться под воздействием как внешних факторов, повреждающих непосредственно ЛЭСК (химический или термический ожог, открытая травма глаза, ультрафиолетовое излучение, ношение контактных линз, применение цитостатиков и др.), так и внутренних, первично действующих на их микроокружение (наследственные, аутоиммунные или системные заболевания, например, синдром Стивенса – Джонсона, Лаела и др.). Все это приводит к снижению численности или гибели ЛЭСК [4, 7]. При этом нарушается естественный барьер, препятствующий миграции на поверхность роговицы эпителия конъюнктивы [8]. Клинически ЛН проявляется нарастанием на роговицу конъюнктивального эпителия (в отличие от роговичного, содержащего бокаловидные клетки) с формированием фиброваскулярного паннуса, хроническим воспалением глазной поверхности с рецидивирующими эрозиями и язвами, рубцеванием и помутнением стромы роговицы. Все это приводит к прогрессирующему cнижению остроты зрения [5].
Для изучения регенеративных процессов и оценки эффективности новых методов лечения при ЛН предложены различные модели ее формирования в эксперименте: резекция лимбальной зоны после механического удаления эпителия роговицы [2], кольцевидное воздействие на нее электрокоагулятором [11], аппликация фильтровальной бумаги, пропитанной 4% NaOH [12], аппликация митомицина С в область лимба [3].
Наиболее доступной, не требующей специальной аппаратуры и химических реактивов, представляется механическая модель. В то же время описанные методики не предусматривают возможность точного интраоперационного контроля глубины резекции с целью предупреждения перфорации глазного яблока.
Цель
Оптимизировать и стандартизировать механическую модель лимбальной недостаточности в эксперименте.
Материал и методы
Экспериментальное исследование выполнено на 10 половозрелых кроликах (20 глаз) породы Шиншилла весом 2,5-3,5 кг. Животным была выполнена седация с помощью введения подкожно 0,4 мл «Ксилавета» («Labiana life science», Испания) и местная эпибульбарная анестезия инстилляциями «Алкаина» («Alcon-Couvreur», Бельгия).
Тотальное механическое удаление роговичного эпителия выполнялось ножом-расслаивателем после 40-секундной аппликации на роговицу фильтровальной бумаги, пропитанной 20% этанолом [6]. Контроль полноты деэпителизации проводился с помощью окрашивания 1% раствором флюоресцеина натрия.
У кроликов ЛЭСК в складках палисад Vogt располагаются на глубине 150-200 мкм [10]. Микрохирургическим алмазным лезвием с дозированной микроподачей центральнее на 2 мм от линии лимба выполняли круговой надрез роговицы на глубину 0,2 мм (рис. 1а). Затем проводили круговую перитомию конъюнктивы на расстоянии 2,0 мм от лимба. После этого на протяжении всего лимба в пределах этих двух круговых надрезов выполняли отсепаровку роговично-конъюнктивального лоскута в виде ленты толщиной около 0,2 мм и шириной 4,0 мм (рис. 1б). Охват по 2,0 мм роговичной и конъюнктивальной части лимба исключал возможность неполного удаления стволовых клеток роговичного эпителия в его ростковой зоне.
В послеоперационном периоде консервативная терапия включала: инстилляции комбинированного препарата «Тобрадекс» («Alcon-Couvreur», Бельгия) и «Корнерегеля» («Dr. Gerhard Mann», Германия) 4 раза в день в течение двух недель. Биомикроскопию выполняли на 3-й, 7-й, 14-й, 30-й день после операции с использованием щелевой лампы фирмы «Carl Zeiss» (Германия) при увеличении 10× и 16×. Для оценки площади деэпителизации роговицы глазную поверхность окрашивали 1% раствором флюоресцеина натрия. На 30-й день проводили импрессионную цитологию (ИЦ) и гистологическое исследование.
Степень васкуляризации роговицы оценивали по 4-х балльной шкале (Inatomi T., 2006) [9]. Оценку интенсивности помутнения стромы роговицы выполняли по десятибалльной шкале (Войно-Ясенецкий В.В., 1979) [1]. Для количественной оценки площади деэпителизации роговицы использовали проекционную сетку (одно деление приравнивалось 2% площади поверхности роговицы).
Забор клеточного материала для ИЦ производили путем аппликации ацетат-целлюлозного диска («МСЕ МЕМВRANE» 0,45 µm) на поверхность роговицы в четырех квадрантах. Материал окрашивали гематоксилином и альциановым синим. Наличие или отсутствие бокаловидных клеток в микропрепарате соответственно свидетельствовало о конъюнктивальном или роговичном фенотипе эпителия.
Гистологическое исследование роговицы выполняли с окрашиванием гематоксилином и эозином. Для идентификации бокаловидных клеток срезы окрашивали гематоксилином и альциановым синим. Световую микроскопию производили на микроскопе «Leica MT 2500» (Германия).
Результаты
У всех животных на 3-й день строма была прозрачной, слегка отечной (0 баллов); неоваскуляризация отсутствовала (0 баллов) (рис. 2А). Отмечали начало эпителизации стромы, дефект эпителия охватывал в среднем 95,3% площади роговицы (рис. 2Б). На 7-й день наблюдалось врастание сосудов в роговицу (1,3 балла) и помутнение стромы (2,3 балла) (рис. 2В); зона деэпителизации сократилась до 67,8% (рис. 2Г). На 14-й день помутнение стромы стало более интенсивным (6,1 балла), а фиброваскулярный паннус дошел до параоптической зоны (3,1 балла) (рис. 2Д). Наблюдали дальнейшее сокращение зоны деэпителизации роговицы до 35,7% (рис. 2Е). На 30-й день отмечали помутнение стромы по типу «матового стекла» (8,1 балла); фиброваскулярный паннус продвинулся в оптическую зону (3,7 балла) (рис. 2Ж), а зона деэпителизации сократилась до 17.8% (рис. 2З).
При гистологическом исследовании в строме роговицы помимо нейтрофилов и макрофагов были выявлены лимфоциты и эозинофилы. Также наблюдали экстравазальные эритроциты (кровоизлияние из новообразованных сосудов). При окраске альциановым синим в эпителии роговицы были выявлены единичные бокаловидные клетки, расположенные на периферии, на расстоянии до 3 мм от лимба (рис. 3).
Методом ИЦ в микропрепаратах был выявлен плоский неороговевающий эпителий роговицы с большим количеством бокаловидных клеток, которые определяли по характерной голубой окраске цитоплазмы клеток и смещенному к периферии фиолетовому ядру.
Таким образом, получена стандартизированная модификация механической модели ЛН, доступная для широкого применения в экспериментальных исследованиях, позволяющая осуществлять интраоперационный контроль заданной глубины резекции лимбальных тканей и исключающая возможность перфорации глазного яблока. В результате полной механической элиминации зоны локализации ЛЭСК предлагаемая модификация механической модели ЛН показала себя эффективной во всех наблюдениях. Надежная определенность результата модели значительно снижает возможность ошибки в оценке эффективности тех или иных методов лечения ЛН. Модель позволяет изучать и сравнивать эффективность различных методов лечения ЛН, таких как лимбальная трансплантация, трансплантация культивированных ЛЭСК на различных носителях, а также трансплантация клеток иного происхождения (буккальных, мезенхимальных стволовых клеток и др.).
Вывод
Предлагаемая модификация механической модели ЛН является вполне эффективной, стандартизированной и доступной для широкого применения в экспериментальных исследованиях.
