Рис. 1. Диаграмма растяжения свиных роговичных дисков ex vivo после УФ облучения с использованием растворов рибофлавина. По оси абсцисс – относительное удлинение материала Δl (мм), по оси ординат – сила приложенной нагрузки P (Н) 1 – интактные, 2 – УФО-хитолинк, 3 – УФО-рибофлавин, 4 – УФО-риболинк, 5 – УФО-декстралинк, 6 – декстран, 7 – УФО.
Рис. 2. Динамика уровня рибофлавина (мг/г) в свиной роговице ex vivo после насыщения офтальмологическими растворами для УФ кросслинкинга
В настоящее время одним из эффективных методов лечения КК признан ультрафиолетовый (УФ) кросслинкинг роговицы (КР) с применением фотосенсибилизатора (ФС) рибофлавина (РФ) [3]. Данная технология способствует повышению прочностных свойств роговицы и приостановке прогрессирования заболевания. В результате УФ кросслинкинга происходит фотополимеризация коллагена роговицы и компонентов основного вещества стромы [4]. Вместе с тем остаются мало изучены механизмы патофизиологических процессов, опосредованных дисбалансом продукции и утилизации активных форм кислорода (АФК), которые протекают в тканях глаза при КР и воздействии УФ излучения на орган зрения. Постоянное совершенствование технологии УФ кросслинкинга требует проведения всестороннего и углубленного исследований в соответствии с критериями безопасности и эффективности процедуры [3, 5]. При этом качество предлагаемых методик КР определяется адекватным дозированием УФ облучения (УФО) и выбором приемлемых растворов для фотосенсибилизации и фотопротекции роговицы с учетом ее индивидуальных особенностей [6-9].
Однако к настоящему времени недостаточно изучены способы оценки активности свободно-радикальных процессов в роговице, происходящих после УФ кросслинкинга, особенности изменения локального и системного цитокинового и антиоксидантного статуса человека. Требуют исследования и обобщения патофизиологические аспекты УФ воздействия на орган зрения и организм в целом. Вышеизложенное послужило основанием для изучения этих вопросов в настоящей работе.
Цель
Установить закономерности и механизмы ультраструктурной трансформации и изменения метаболизма роговицы при УФ воздействии.
Материал и методы
Эксперименты выполнены на 96 крысах-самцах линии Вистар и 164 кроликах породы Шиншилла, 360 свиных глазах. Объекты исследования разделены на 6 групп: 1-я – интактные, 2-я – производили УФ облучение роговицы без РФ, 3-я – УФ кросслинкинг с раствором изоосмотического РФ (контроль), в 4–6-я – УФ кросслинкинг с разработанными растворами РФ (Декстралинк, Риболинк и Хитолинк).
Модель стандартного УФ кросслинкинга роговицы глаза крыс и кроликов in vivo воспроизводили при анестезиологическом пособии препаратами Золетил 15 мг/кг («Valdepharm», Франция) и Ксилазин (20 мг/кг) («Ветфарм», Беларусь), местной анестезии 0,4%-м оксибупрокаином. Корнеальную деэпителизацию проводили диаметром 3 мм у крыс и 3, 6, 9 мм – у кроликов. УФО роговицы выполняли с помощью устройства «УФалинк» (Россия) с длиной волны 370 нм при мощности 3 мВт/см² продолжительностью 10-30 мин. УФ облучение свиных роговиц с РФ и без него производили ex vivo в режиме 3 мВт/см² продолжительностью от 1 мин. до 30 мин.
Насыщение свиных роговиц ex vivo, роговиц крыс и кроликов in vivo выполняли посредством инстилляций разработанных растворов с РФ мононуклеотидом: «Декстралинк» (0,1%-м РФ с 20%-м декстраном); «Риболинк» (0,1%-м РФ с 1,0%-й гидроксипропилметилцеллюлозой); «Хитолинк» (0,1%-м РФ с 1,0%-м хитозаном сукцинатом).
Забор влаги передней камеры (ВПК) кроликов производили в объеме около 0,2 мл через парацентез иглой 30 G после завершения инстилляций ФС и промывания конъюнктивальной полости стерильным физраствором.
Толщину свиных роговиц ex vivo определяли в центральной зоне с помощью микрометра Digital linear gauge EG-100 (Япония). Исследование биомеханических показателей роговицы выполняли после УФ воздействия и УФ кросслинкинга с рибофлавином роговичных полос и дисков с последующим их тестированием на универсальной разрывной испытательной машине. Механическую прочность роговиц оценивали по величинам показателей разрывной нагрузки образцов на диаграмме «приложенная сила – относительное удлинение», величинам относительного удлинения и по результатам расчета модуля Юнга.
Величину сравнительной УФ абсорбции свиной роговицей в присутствии растворов рибофлавина ex vivo оценивали по поглощению света от излучателя «УФалинк», проходящего через изолированную роговицу, размещенную на фотоприемном элементе УФ-радиометра («НТП ТКА», Россия). Регистрацию показаний с него после завершения насыщения роговицы и удаления излишков раствора РФ с ее поверхности, осуществляли в течение 30 минут.
Количественное определение РФ проводили в прецизионных навесках свиных и кроличьих роговиц после извлечения из них действующего вещества и измерения его оптической плотности в растворе с использованием спектрофотометра СФ-56 (Россия). Содержание РФ во ВПК кроликов производили с помощью автоматического иммуноферментного анализатора «Multiscan» (Финляндия) при длине волны 610 нм и тест-систем ID-Vit (Immundiagnostik, Германия).
Для изучения состояния процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли уровень продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), который исследовали с применением набора реактивов «ТБК-АГАТ» (Россия). Оптическую плотность образовавшихся комплексов определяли при длинах волн 535 и 570 нм с помощью спектрофотометра СФ-56 (Россия).
Гистологические исследования выполняли по общепринятым методикам. Для электронномикроскопического исследования фрагменты роговицы животных фиксировали в растворе 2%-го глутарового альдегида. Обезвоживание и заливку в эпон-812 проводили по общепринятой методике. Ультратонкие срезы производили с помощью ультрамикротома «LEICA EM UC7» (Германия), контрастировали цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе «JEM-1011» (Япония). Определение изменений плотности фибриллярной упаковки коллагеновых волокон роговицы выполняли по методу Pinelli (2009) на микрофотографиях при увеличении ×15000.
Прижизненное морфологическое исследование и определение плотности кератоцитов роговицы кроликов проведены под общим наркозом методом конфокальной микроскопии с помощью лазерного сканирующего томографа HRT-III (Германия) с насадкой «Rostok».
Срок наблюдений при проведении гистологического, электронномикроскопического и прижизненного морфологического исследований составил 3, 7, 14, 30 и 90 суток.
В клинические наблюдения включены 92 пациента с КК I, II стадии по классификации Amsler (1961), которым проводился стандартный и трансэпителиальный УФ кросслинкинг роговицы. Группа контроля – 42 практически здоровых добровольца.
Протокол стандартной техники КР: под местной анестезией после деэпителизации роговицы (Epi-Off) диаметром около 8-9 мм производятся инстилляции раствора «Декстралинк» (Россия) из расчета 1 капля / 2 мин в течение получаса. Насыщение роговицы РФ оценивалось по люминесценции влаги передней камеры при биомикроскопии с кобальтовым (синим) светофильтром. Для облучения роговицы использовалось устройство офтальмологическое «УФалинк» (Россия) в режиме 3 мВт/см², 30 мин при длине волны 370 нм с одновременными инстилляциями средства «Декстралинк».
Трансэпителиальная техника КР выполнялась без удаления эпителия (Epi-On) роговицы с этапом предварительного насыщения посредством электрофореза с раствором 0,1% -го РФ в течение 15 мин, силой тока 1,0 мА с использованием гальванизатора «Поток-1» (Россия). Этап УФ облучения роговицы был аналогичен стандартной методике.
Забор слезной жидкости (СЖ) выполняли у больных до операции, на 3, 7 и 14 сутки после УФ кросслинкинга стандартным и трансэпителиальным способами. Для получения сыворотки крови (СК) после ретракции сгустка пробы центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин.
Определение уровней TNF-α, IL-1β, TGF-β1, TGF-β2, IFN-α в СЖ и СК проводили с применением стандартных диагностических наборов «Вектор-Бест» (Россия) и «eBioscience» (Австрия) с помощью автоматического иммуноферментного анализатора «Multiscan» (Финляндия) при длине волны 450 нм.
Оценку общего антиоксидантного статуса СЖ и СК пациентов осуществляли с помощью тест-системы «Total antioxidant status» (Randox Laboratories Ltd., Великобритания) на фотометре SF-Ultra (Россия). Определение содержания супероксиддисмутазы в СЖ и СК выполняли с использованием тест-набора «eBioscience» (Австрия) на фотометре StatFax (США) и TECAN INFINITE F-50 (Австрия).
Все числовые данные обрабатывали методом вариационной статистики, представляли в виде средней арифметической величины – M (Mean) и стандартного отклонения – σ (Standard Deviation). Для оценки достоверности непараметрических количественных данных использовали критерий Манна-Уитни, для определения достоверности нормально распределенных данных – критерий Стьюдента. Статобработку проводили с помощью пакета программ Statistica 6.1 и Excel 2010 методами параметрической и непараметрической статистики.
Результаты и обсуждение
Таблица 1 Влияние ультрафиолетового облучения роговицы крыс на плотность фибриллярной упаковки волокон и диаметр фибрилл коллагена (M±σ)
Таблица 2 Уровень цитокинов в слезной жидкости пациентов с кератоконусом после стандартного (s-CXL) и трансэпителиального (t-CXL) УФ кросслинкинга роговицы в динамике исследования (M±σ, пг/мл)
Инстилляции разработанных растворов при проведении экспериментальных исследований ex vivo и in vivo способствовали насыщению роговицы РФ аналогично контрольному раствору (изоосмотический РФ). Толщина роговицы при этом значимо не изменялась по сравнению с контролем. Исключением явился декстралинк, способствовавший снижению толщины роговицы на 24% (р<0,05) за счет ее дегидратации, наблюдаемой уже с 5-й мин. инстилляций.
Сохранение стабильной толщины роговицы при использовании средств риболинк и хитолинк в процессе инстилляций, наряду с выявленной особенностью декстралинка снижать толщину оптической оболочки, позволило рекомендовать указанные растворы для дифференцированного использования при проведении КР у пациентов с КК: при показателе более 450 мкм – рекомендуется декстралинк, 400-450 мкм – риболинк [10].
УФ обработка роговиц в присутствии РФ способствовала значимому росту предела прочности свиных роговичных полос и дисков на 202-246% – максимум кривой на графике (рис. 1). Отмечалось также увеличение модуля Юнга у свиных роговичных полос, обработанных УФ с рибофлавинсодержащими растворами, на 203-232% по сравнению с результатами контрольной группы. Все средства способствовали повышению жесткости оптической оболочки без значимых отличий между опытными группами [11]. В исследование дополнительно включили группу, в которой проводилось УФ воздействие на роговицу без РФ с тем, чтобы оценить возможное влияние излучения на ее биомеханику. Кроме этого, в отдельной группе изучали прочность роговиц, обработанных декстраном, без УФ облучения.
Установлено заметное увеличение прочностных свойств роговичных дисков и полос, облученных ультрафиолетом без РФ, при котором модуль Юнга возрос в среднем на 54-130%, а предел прочности – на 86-133%; в группе с декстраном, соответственно, на 13-73% и 24-77%, т.е. УФ воздействие или дегидратация стромы способствуют дополнительному увеличению жесткости роговицы.
Таким образом, УФО свиных роговиц в присутствии исследуемых растворов РФ (декстралинк, риболинк, хитолинк) оказывало статистически значимое повышение прочностно-механических свойств корнеальной ткани, связанное с фотополимеризацией коллагеновых волокон стромы. Заметное увеличение жесткости роговицы может происходить также за счет ее УФ облучения или обезвоживания.
Эффективный УФ кросслинкинг роговицы и повышение ее прочностных свойств может быть достигнуто за счет стабильной интрастромальной концентрации РФ, который обеспечивает необходимую защиту глублежащих слоев роговицы – чувствительного эндотелия и внутриглазных структур от негативного воздействия УФ облучения. Динамика уровня РФ в роговице при инстилляциях исследуемых растворов характеризовалась непрерывным ростом концентрации ФС в течение часа (рис. 2).
Однотипность изменений содержания РФ выявлена как для исследований in vivo, так и ex vivo. При исходно равной концентрации действующего вещества в растворе наибольшую способность к насыщению стромы демонстрировал раствор риболинка (РФ с гидроксипропилметилцеллюлозой). Также количественное содержание РФ в ткани роговицы при инстилляциях имело прямую зависимость от площади удаленного эпителия, что было определено по уровню ФС во влаге передней камеры кроликов в условиях деэпителизации оптической оболочки диаметром 3, 6 или 9 мм. Наиболее эффективное насыщение и достаточное пропитывание оптимальной площади стромы РФ может быть обеспечено за счет тотальной деэпителизации роговицы кролика – около 9 мм. Концентрация РФ в роговице после насыщения препаратом декстралинк, начиная с 15 мин. наблюдений, была меньше, чем при использовании других растворов, возможно, из-за декстранопосредованного снижения толщины роговицы.
Таким образом, диффузия рибофлавина в роговицу обусловлена составом основы используемых растворов, а эффективность насыщения стромы ФС может быть достигнута за счет максимального устранения эпителиального барьера.
Насыщенная РФ строма образует систему «роговица – РФ» (Р-РФ), которая, обладая возросшей степенью УФ поглощения, по сравнению с интактной оптической оболочкой, обеспечивает защиту глублежащих интраокулярных структур. Установлено, что интактная свиная роговица пропускала около 20% ультрафиолета от исходной мощности, в то время как после 5-30 мин инстилляций раствора 0,1% изоосмотического РФ интенсивность проникновения УФ излучения достоверно снижалась, соответственно, в 5,7-315 раз от значений необработанной роговицы. УФ абсорбирующая способность роговиц, насыщенных РФ с помощью декстралинка, была ниже, чем при использовании изоосмотического раствора, риболинка или хитолинка. Однако через 30 мин светопропускающая способность системы Р-РФ во всех группах находилась в пределах 0,002 - 0,06 мВт/см², что существенно ниже порога повреждающего действия УФО (0,35 мВт/см²) для эндотелия роговицы.
Нами была исследована УФ абсорбция системы «роговица – РФ – прекорнеальная пленка» (Р-РФ-П). Установлено фотопротекторное действие по отношению к ультрафиолету средств декстралинк, риболинк и хитолинк, при использовании которых более устойчивый вязкий рибофлавиновый слой поглощал до 50% энергии излучения, а при инстилляциях изоосмотического раствора рибофлавина – только 25%. Риболинк и хитолинк, кроме повышенной, по сравнению с изоосмотическим раствором, проникающей способности РФ в роговицу, обеспечивали стабильность образуемой пленки ФС. Декстралинк, истончая роговицу и в меньшей степени насыщая ее РФ, свой фотозащитный эффект от УФО реализовывал преимущественно за счет прекорнеальной рибофлавиновой пленки.
Для изучения состояния процессов перекисного окисления липидов в тканях глаза определяли уровень продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-рп), в супернатантах гомогенатов роговиц. Так через час после УФО отмечали достоверный рост концентрации ТБК-рп на 26% (р<0,05), а при кросслинкинге с РФ – лишь на 15%. На 4-14 сутки величина показателя в группах приближалась к контрольным значениям. Уровень ТБК-рп в супернатантах гомогенатов глазного яблока крыс после воздействия УФ излучения (1 ч) на роговицу достоверно увеличивался на 44% (р<0,05) с последующей (на 7-17 сутки) его нормализацией. Деэпителизация роговицы на данный параметр значимо не влияла.
Таким образом, одним из ключевых патогенетических факторов УФ воздействия на роговицу является индукция свободно-радикальных процессов с активацией ПОЛ, которые в определенной степени компенсируются при УФО в присутствии фотосенсибилизатора и фотопротектора РФ. Незначительное повреждающее воздействие деэпителизации роговицы выраженного влияния на интенсивность процессов ПОЛ не оказывало.
Состояние ультраструктуры роговицы после КР в присутствии разработанных растворов РФ оценивали по изменению плотности фибриллярной упаковки и диаметра коллагеновых фибрилл стромы крыс. Во всех группах отмечали снижение плотности фибриллярной последовательности на 3 сутки после УФ воздействия, в т.ч. в присутствии РФ, по сравнению с интактной роговицей (табл. 1). К завершению срока наблюдений (90 суток) значения показателя приближались к норме. При этом существенных отличий между группами, при использовании исследуемых растворов РФ, не обнаружено.
КР в присутствии рибофлавинсодержащих растворов способствовал увеличению диаметра фибриллярного коллагена в среднем на 6 - 9%. При УФ облучении без ФС также определяли незначительный (на 3,5%) прирост диаметра фибрилл.
Полученные результаты исследований основывались на статистических данных нормального распределения диаметра коллагеновых фибрилл роговицы. Установлено, что наибольшее количество фибрилл после УФ воздействия без РФ имели диаметр 34-36 нм, после КР с разработанными растворами РФ – 36-40 нм (в норме – 34-38 нм).
По данным конфокальной микроскопии, КР с применением изоосмотического (контроль) и исследуемых растворов РФ (декстралинк, риболинк и хитолинк) вызывал однотипные морфологические изменения в роговице кролика in vivo.
Анализ гистоморфологической картины роговицы экспериментальных животных показал, что воздействие УФ излучения в присутствии рибофлавинсодержащих растворов характеризуется временным набуханием стромы и десцеметовой мембраны (3-7 сутки), гибелью кератоцитов преимущественно в передних и средних слоях стромы (3-30 сутки), не затрагивая задние слои и эндотелий. Отсутствие РФ в роговице при ее УФ облучении, кроме отека и гибели кератоцитов во всех слоях стромы, вызывало патологические последствия необратимого характера: интракорнеальную васкуляризацию, нарушение целостности десцеметовой мембраны, повреждение эндотелия.
Для оценки влияния КР на динамику локального и системного уровня цитокинов и антиоксидантного статуса были проведены клинические наблюдения пациентов с КК [12-15]. Особенности локального цитокинового статуса больных КК до процедуры УФ кросслинкинга были связаны с 10 и 25-кратным повышением содержания соответственно TGF-β1 и -b2, в сравнении с нормой (табл. 2).
Соответственно, в динамике стандартного КР выявлен 2,5-кратный рост содержания факторов роста на 7 и 3 сутки наблюдений, относительно дооперационных значений. Содержание TNF-α в СЖ больных с КК превышало показатели контроля более чем в 2 раза. Через 3-7 дней после s-CXL и t-CXL кросслинкинга роговицы местный уровень TNF-α практически не изменялся, при некотором снижении на 14-е сутки. Дооперационная концентрация IL-1β была в пределах контрольных значений. На 3-и сутки после s-CXL уровень данного цитокина превышал в 2 раза, а после t-CXL – в 1,5 раза дооперационные данные с последующей нормализацией показателей до исходных величин.
Величина IFN-α в слезе больных КК достоверно отличалась от контроля в 2,7 раза. Ее максимальную концентрацию обнаруживали на 3-и сутки после процедуры в обеих наблюдаемых группах при более выраженном росте у пациентов со s-CXL. На 7-14 сутки наблюдений содержание IFN-α в СЖ после s-CXL и t-CXL достоверно уменьшалось, приближаясь к дооперационным значениям.
Следует отметить, что у пациентов с КК после t-CXL каких-либо значимых изменений в уровнях исследованных цитокинов не установлено, что, очевидно, обусловлено с отсутствием травмирующего воздействия стандартной методики, связанного с деэпителизацией роговицы.
Динамика содержания TNF-α, IL-1β и IFN-α в СК пациентов с КК после s-CXL и t-CXL не имела статистически значимых отличий от параметров нормы и дооперационных показателей в течение всего периода наблюдений.
Выявлено достоверное снижение общего антиоксидантного статуса (ОАС) слезной жидкости пациентов с КК до лечения на 40% (р<0,05). При этом содержание супероксиддисмутазы (СОД) на фоне заболевания было меньше нормы в среднем на 18,8%. Стандартный КР усугублял патологическое состояние антиоксидантной системы роговицы в раннем послеоперационном периоде (3-7-е сутки), что выражалось в уменьшении уровня СОД слезы на 70% (р<0,05) и ОАС на 52% (р<0,05), по сравнению с дооперационными данными. Трансэпителиальная техника КР вызывала менее значимые отличия от исходных значений, соответственно, на 58% и 41% (р<0,05).
Минимальные значения СОД и ОАС слезы регистрировали на 3-и сутки после процедуры УФ кросслинкинга с последующей тенденцией к восстановлению дооперационных показателей, что в целом по срокам соответствовало росту активности процессов свободно-радикального окисления. Не наблюдали значимых системных отличий ОАС и уровня СОД у пациентов с КК в сроки до 14 суток после УФ кросслинкинга, по сравнению с нормой [16].
Установленные механизмы межмолекулярных и межклеточных взаимодействий в тканях после КР с рибофлавином можно охарактеризовать следующим образом. Одним из первоочередных внешних воздействий на роговицу является удаление эпителия, которое инициирует выброс провоспалительных цитокинов, в частности IL-1β, на 3-7-е сутки после выполнения процедуры. При этом отмечается активная продукция трансформирующих факторов (TGF β1, -β2). В дальнейшем деэпителизация роговицы с ее УФО способствует усилению процессов клеточной пролиферации и миграции с образованием активированных кератоцитов (фибробластов).
Использование рибофлавина для насыщения стромы с последующим УФ облучением роговицы длиной волны 370 нм приводит к усиленному образованию в ней АФК, в частности супероксид анион-радикала, гидроксильного радикала, синглетного кислорода, которые инициируют фотохимические взаимодействия в тканях оптической оболочки, изменяя ее ультраструктуру и повышая биомеханические свойства. Вместе с тем продукция АФК вызывает интенсификацию свободно-радикального окисления в роговице с усилением процессов ПОЛ и образованием их метаболитов [9]. Отмечается местное снижение антиоксидантного статуса, наряду с уменьшением уровня СОД. При этом наблюдается гибель кератоцитов, которая охватывает преимущественно переднюю и среднюю строму, не затрагивая глублежащие слои, включая эндотелий роговицы.
Заключение
Для выполнения безопасного и эффективного УФ кросслинкинга роговицы необходимо качественное насыщение стромы РФ, которое может быть достигнуто преимущественно за счет достаточной площади деэпителизации (не менее 8-9 мм). УФ кросслинкинг роговицы с применением разработанных растворов РФ в качестве фотосенсибилизаторов способствует повышению ее прочностных свойств, связанных с изменением структурного состояния коллагеновых фибрилл.
Доказано, что рибофлавин-УФ воздействие на переднюю фиброзную оболочку глаза обусловлено кратковременным локальным усилением свободно-радикальных процессов, снижением общего антиоксидантного статуса, отсутствием некротических и значимых воспалительных реакций. Показано, что недостаток РФ в строме формирует последовательность патоморфологических событий необратимого характера, приводящих к потере нативной структуры роговицы. На основании проведенных исследований обоснована необходимость дифференцированного подхода к применению рибофлавинсодержащих растворов при проведении УФ кросслинкинга роговицы. При выполнении УФ кросслинкинга с ФС, содержащим декстран, рекомендуется предварительное насыщение роговицы продолжительностью не менее 30 минут. Минимальная толщина роговицы, при которой может использоваться средство декстралинк, должна быть не менее 440-450 мкм. Применение риболинка с гидроксипропилметилцеллюлозой, обладающего хорошей способностью к пенетрации в строму, допустимо на роговицах, толщиной не менее 400 мкм, а длительность этапа насыщения может быть сокращена до 20-25 минут.
