Молекулярные маркеры апоптоза и пролиферации при УФ-кросслинкинге роговицы. Экспериментальное исследование

    Актуальность

    Ультрафиолетовый (УФ) кросслинкинг (сшивание) роговицы способствует образованию поперечных связей в макромолекулах коллагена стромы, чем способствует укреплению роговой оболочки и повышению ее жесткости [1]. Этот метод также используется для лечения ряда других заболеваний роговицы, таких как буллезная кератопатия, инфекционный и язвенный кератит [2–6]. Методика кросслинкинга успешно сочетается с хирургическими вмешательствами, в частности, с рефракционной целью [7]. УФ-кросслинкинг предполагает нанесение на роговицу раствора рибофлавина (витамин B2) и ее УФ-А-облучение длиной волны 370 нм.

    Сочетание рибофлавина и УФ-А-излучения индуцирует образование свободных кислородных радикалов, что позволяет формировать новые внутри- и межфибриллярные ковалентные связи в стромальном коллагене, улучшая не только биомеханические, но и биохимические свойства роговицы, что особенно важно при лечении кератоконуса или вторичных пост-LASIK эктазий [8].

    К кросслинкинг-индуцированным осложнениям в послеоперационном периоде относят, в частности, транзиторное помутнение стромы, стромальную дегенерацию [9, 10]. Это связывают с глубиной состоявшегося кросслинкинга и потерей кератоцитов за счет апоптоза, признаки которого могут выявляться различными иммунологическими методами [11–13]. Оценка выраженности этого процесса является важным аспектом обеспечения эффективности и безопасности УФкросслинкинга. Исследование про- и противоапоптотических процессов в роговице после проведенной процедуры УФ-кросслинкинга в условиях применения кератопротекторов представляет значимый научный и практический интерес.

    Цель

    Изучить влияние УФ-кросслинкинга роговицы крыс на экспрессию показателей апоптоза и пролиферации кератоцитов Bcl-2, Bax, индекс Bcl-2/Bax и Ki-67.

    Материал и методы

    Исследования были проведены с использованием крыс-самцов Wistar с массой тела 200–250 г, которых содержали в пластиковых клетках при естественном освещении, температуре 22–24 °С и свободном доступе к воде. Рацион животных составляли брикетированные комбикорма. Все манипуляции с животными проведены в соответствии с принципами, утвержденными локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России (Приказ № 220 от 30.12.2016) и установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Директива Европейского парламента и Совета ЕС 2010/63/ЕС от 22.09.2010 о защите животных, использующихся для научных целей) [14].

    Эксперименты проведены (n=10) в 2 группах (n=5 в каждой): 1-я группа интактная (контроль), во 2-й группе выполнен стандартный УФ-кросслинкинг роговицы с рибофлавином (опыт) под общим наркозом (Ксилазин 20 мг/кг и Золетил 15 мг/кг, внутримышечно) и местной анестезией (инстилляции глазных капель Инокаин).

    Была воспроизведена модель стандартного УФкросслинкинга роговицы крысы (2-я группа): после деэпителизации роговицы диаметром 3 мм под операционным микроскопом (Carl Zeiss, Германия) проводили закапывание раствора ДЕКСТРАЛИНК (0,1% рибофлавина мононуклеотид и 20% декстран с молекулярной массой 500 kDa) с частотой 1 капля/2 мин и УФ-А-облучение роговицы с помощью устройства «УФалинк» (Россия) в режиме 3 мВт/см2 течение 30 мин и длине волны 370 нм.

    На 14-е и 30-е сутки животных выводили из эксперимента путем передозировки паров хлороформа, извлекали глазные яблоки, которые подвергали морфологическому исследованию: фиксировали в 10% нейтральном формалине, затем разрезали их вдоль сагиттальной оси от заднего наружного полюса орбиты до вершины роговицы. Каждый блок обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заливали в парафин по общепринятой методике. Гистологические срезы готовили с использованием микротома LEICA RM 2145 (Германия), окрашивали гематоксилином и эозином.

    Для иммуногистохимических исследований готовили парафиновые срезы толщиной 4 мкм, которые окрашивали с использованием иммуногистостейнера Leica Microsystems Bond (Германия). В качестве первичных антител использовали: Bcl-2 в разведении 1:500, Bax в разведении 1:200, Ki-67 в разведении 1:300 (Affinity Biosciences, КНР).

    Для окрашивания использовали непрямую стрептавидин-биотиновую систему детекции Leica BOND (Novocastra, Германия). Оценку специфичности реакции проводили при окрашивании срезов без первичных антител. Визуализацию и исследование препаратов проводили с использованием микроскопа Leica DMD 108 (Германия) со специализированным программным обеспечением.

    Для анализа проводили подсчет концентрации позитивно окрашенных кератоцитов из расчета на 100 клеток в основном веществе роговицы в процентах в 20 полях зрения при 400-кратном увеличении цифровых изображений. Для проверки нормальности распределения изученных параметров использовались критерии Колмогорова — Смирнова и Шапиро — Уилка. Для оценки статистической значимости различий количественных показателей между исследуемыми выборками использовали U-критерий Манна — Уитни. Определяли медиану и квартили (Q25; Q75). Результаты считали достоверными при уровне статистической значимости р<0,05.

    Статистическая обработка результатов выполнена в программном обеспечении Statistica 10,0.

    Результаты

    Гистологические исследования показали, что собственное вещество роговицы интактных крыс покрывала ровная полоса переднего эпителия, который представлен многослойным плоским неороговевающим эпителием, состоящим из базального, шиповатого и поверхностного слоев, которые плотно прилежали друг к другу. В соединительнотканной основе роговицы под передним эпителием определялись параллельные роговичные пластинки, состоящие из пучков коллагеновых волокон, между которыми выявлялись многочисленные кератоциты с базофильно окрашивающимися вытянутыми ядрами. На внутренней стороне стромы роговицы определялась десцеметова мембрана, которую выстилали светлые эндотелиальные клетки с темными ядрами.

    В опытной группе через 14 суток на гистологических препаратах роговой оболочки глаза опытных крыс выявлялись патологические изменения в виде набухания или деструкции стромы. Следует отметить, что указанные нарушения более выражены в раннем послеоперационном периоде (3-и сутки) [15].

    В субэпителиальном слое основного вещества определялась нейтрофильная инфильтрация. Общая структура и направленность пучков коллагеновых волокон в стромальной пластинке сохранялась. Между ними определялись веретеновидные очертания клеток — кератоцитов. Структура переднего эпителия была частично нарушена за счет отека, десквамации, дезорганизации. Строение эндотелия роговицы было сохранено.

    Задний эпителий в виде однослойной полосы из светлых клеток с темными ядрами выявлялся на задней пограничной мембране. Через 30 суток роговая оболочка глаз была без признаков патологических морфологических изменений в виде набухания коллагеновых волокон стромы или эпителия. Общая структура и направленность пучков коллагеновых волокон в стромальной пластинке сохранялась. Очертания кератоцитов стромы хорошо просматривались между параллельно лежащими роговичными пластинками. Структура переднего и заднего эпителия роговицы также сохранялась. Передний плоский неороговевающий эпителий плотно лежал на Боуменовой мембране, а задний эпителий в виде однослойной полосы из светлых клеток с темными ядрами выявлялся на десцеметовой мембране.

    Для выявления признаков влияния УФ-кросслинкинга роговицы крыс на показатели апоптоза и пролиферации кератоцитов в различные сроки были использованы иммуногистохимические методы определения Bcl-2, Bax, Ki-67. Также проводили анализ результатов, сопоставляя данные опытной группы с интактным контролем (рис.). Bcl-2 и Bax в основном локализовались в цитоплазме, а Ki-67 — в ядрах клеток. Числовые данные концентрации искомых клеток в основном веществе роговицы представлены в таблице.

    В опытной группе спустя 14 суток численность Bcl-2- позитивных клеток была достоверно снижена по сравнению с интактной группой (р=0,0059). В последующем (на 30-е сутки) отмечали рост показателя, однако между интактной и опытной группами различий в численности клеток не наблюдалось (р=0,0801). Внутригрупповой паттерн экспериментальных групп с временным интервалом 14–30 суток был статистически не значим.

    Количество Bcl-2 окрашенных клеток на 14-е и 30-е сутки достоверно не отличалось (p=0,0801).

    Количество Bax+-клеток спустя 14 и 30 суток после УФ-кросслинкинга по сравнению с интактной группой имело существенные различия (р=0,0001) — отмечали 5-кратное увеличение показателя. Уровень Bax+- кератоцитов между 14-ми и 30-ми сутками оставался без изменений и был статистически не значим (р=0,4836).

    Численность пролиферирующих клеток Ki-67 между контролем и 2-й группой (14-е сутки) не различалась (р=0,1213). На 30-е сутки между интактной и опытной группами были выявлены следующие изменения в количестве клеток: с 75,5% (54,3%; 76,2%) до 80,8% (76,3%; 86,2%) (р=0,0001) соответственно. Установлено, что количество Ki-67+-клеток с 14 до 30 суток достоверно увеличивалось с 76% (73%; 78%) до 80,8% (76,3%; 86,2%) (р=0,0098).

    Отношение Bcl-2/Bax имело тенденцию к значимому снижению в группе применения УФ-кросслинкинга с рибофлавином (р=0,0001) по сравнению с контрольной группой. И в последующем данная тенденция сохранялась без изменений (р=0,2112).

    Обсуждение

    Bcl-2 является антиапоптотическим [16], а Bax — проапоптотическим белком митохондриального пути активации апоптоза, который происходит через белок р53, а инактивация — через димеризацию с белком Bcl-2 [17].

    В нормальных клетках белки Bcl-2, способствующие ее выживанию, сдерживают эффекторы апоптоза Bax и Bak [18]. Белок р53 является транскрипционным фактором, регулирующим функцию большинства генов, выполняя супрессорную функцию (остановка клеточного цикла, репарация ДНК и апоптоз). Белки семейства Bcl-2 (около 20 белков) расположены на наружной митохондриальной мембране, способны к димеризации — от вида димеризации (анти- и проапоптотических белков) и их баланса зависят проницаемость митохондриальной мембраны и вступление клетки в апоптоз [19].

    В контрольной группе синтез антиапоптотического Bcl-2 значительно опережал синтез проапоптотического Вах, что способствует высокому уровню выживаемости кератоцитов в нормальной роговице крысы.

    В опытной группе уровень Bcl-2+-клеток спустя 14 суток был значимо ниже, чем в контроле, но со временем восстанавливался до значений интактных животных.

    Изменения количества Bax+-кератоцитов в опытной группе носили противоположный характер. Численность данных клеток была существенно выше контрольных значений, которые сохранялись вплоть до 30 суток. Но развитие апоптоза не фатально, процесс может быть остановлен. Вcl-2 и Вax могут образовывать гетеродимеры, олигомеры. Причем это взаимодействие оказывается важным для способности Вcl-2 блокировать гибель клетки [20]. Поэтому соотношение белков Bcl-2 и Bax, или индекс выживаемости клетки, служит определяющей характеристикой клеточного потенциала к апоптозу [21].

    В нашем исследовании индекс выживаемости клеток в опытной группе был близок к единице, что обеспечивало относительное равновесие клеточного гомеостаза.

    При этом снижение стрессового сигнала могло происходить также за счет основного рибофлавина. Последний, как известно, играет двоякую роль — выступает в качестве фотосенсибилизатора, участвующего с УФ-Аизлучением (370 нм) в продукции активных форм кислорода, и фотопротектора, способствующего значительному снижению негативных последствий, вызванных индуцированной оксидативной агрессией [22, 23]. Ki-67 — антиген, ассоциированный с пролиферацией клеток. Ki-67 экспрессируется во время фаз пролиферации и синтеза клеточного цикла (G1, S, G2 и M), однако не экспрессируется в фазе G0 [24].

    Маркер клеточной пролиферации Ki-67 в опытной группе в ранние сроки наблюдения (14 суток) не имел существенных отклонений от нормы, а по истечении 30 суток значимо повышался, что свидетельствовало о поддержании пролиферативной активности кератоцитов на фоне УФ-облучения роговицы в присутствии рибофлавина. Исходя из анализа морфологических данных, можно предположить, что увеличение уровня пролиферативно-активных кератоцитов связано с постепенным восстановлением структуры роговой оболочки.

    Заключение

    В кератоцитах интактных крыс преобладает экспрессия антиапоптотического фактора Bcl-2, способствующего сохранности клеток, над проапоптотическим белком Вах. У животных после УФ-кросслинкинга роговицы численность Bcl-2-положительных клеток была достоверно снижена по сравнению с нормой, а число Baxиммунопозитивных кератоцитов повышено, что может свидетельствовать об активации системы апоптоза. В последующем (30-е сутки) наблюдали относительное восстановление числа Bcl-2-окрашенных клеток.

    Количественные значения Ki-67-позитивных кератоцитов демонстрировали тенденцию к росту на 30-е сутки эксперимента, что коррелировало с нормализацией морфологической структуры роговицы и может указывать на наличие пролиферативного потенциала клеток.

    Информация об авторах

    Мухаррам Мухтарамович Бикбов, д.м.н., проф., директор Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, niipriem@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-9476-8883

    Азат Рашидович Халимов, д.б.н., зав. научно-инновационным отделом Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, azrakhal@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-7470-7330

    Анна Ивановна Лебедева, д.б.н., зав. отделом морфологии Всероссийского центра глазной и пластической хирургии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, jeol02@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-9170-2600

    Ляля Ахияровна Мусина, д.б.н., ведущий научный сотрудник отдела морфологии Всероссийского центра глазной и пластической хирургии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, morphoplant@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-1237-9284

    Искандер Дамирович Валишин, врач-офтальмолог 1-го офтальмологического отделения Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, iskander0796@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-1811-9320

    Лейсан Ильшатовна Гилемзянова, зав. лабораторией экспериментальных исследований Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, gileisan@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-0583-013X

    Information about the authors

    Mukharram М. Bikbov, Doctor of Sciences in Medicine, Professor, Director of Ufa Eye Research Institute, niipriem@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-9476-8883

    Azat R. Khalimov, Doctor of Sciences in Biology, Head of the scientific and innovative department, azrakhal@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-7470-7330

    Anna I. Lebedeva, Doctor of Sciences in Biology, Head of the morphology department, jeol02@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-9170-2600

    Lyalya A. Musina, Doctor of Sciences in Biology, Senior researcher at the morphology department, morphoplant@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-1237-9284

    Iskander D. Valishin, Ophthalmologist of the 1st ophthalmology department, iskander0796@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-1811-9320

    Leysan I. Gilemzyanova, Head of the laboratory of experimental research, gileisan@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-0583-013X

    Вклад авторов в работу:

    М.М. Бикбов: существенный вклад в концепцию и дизайн работы.

    А.Р. Халимов: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, редактирование.

    А.И. Лебедева: сбор, анализ и обработка материала, написание текста, редактирование.

    Л.А. Мусина: сбор, анализ и обработка материала, написание текста, редактирование.

    И.Д. Валишин: сбор, анализ и обработка материала.

    Л.И. Гилемзянова: сбор, анализ и обработка материала.

    Authors’ contribution:

    M.M. Bikbov: significant contribution to the concept and design of the work.

    A.R. Khalimov: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of material, editing.

    A.I. Lebedeva: collection, analysis and processing of material, writing, editing.

    L.A. Musina: collection, analysis and processing of material, writing, editing.

    I.D. Valishin: collection, analysis and processing of material.

    L.I. Gilemzyanova: collection, analysis and processing of material.

    Финансирование: Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-25-00132 (https://rscf.ru/project/24-25-00132/).

    Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Funding: The work was carried out at the expense of the grant of the Russian Science Foundation No. 24-25-00132 (https://rscf.ru/project/24-25-00132/).

    Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.

    Conflict of interest: There is no conflict of interest.

    Поступила: 23.09.2025

    Переработана: 28.10.2025

    Принята к печати: 18.11.2025

    Received: 23.09.2025

    Revision: 28.10.2025

    Accepted: 18.11.2025