Морфологические изменения роговицы экспериментальных животных после ультрафиолетового кросслинкинга

    Актуальность

    Ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы (КЛР) является признанным методом стабилизации прогрессирующего кератоконуса [1]. Методика основана на фотохимической реакции между ультрафиолетовым (УФ) излучением с длиной волны 370 нм и фотосенсибилизатором (рибофлавин), в результате которой образуются дополнительные внутри- и межфибриллярные коллагеновые связи в строме, существенно повышающие ее биомеханическую жесткость [2]. В настоящее время при выполнении КЛР чаще всего в качестве фотосенсибилизатора используется раствор, содержащий 0,1% рибофлавин с 20% декстраном. В России для этих целей применяется отечественный препарат ДЕКСТРАЛИНК. Окулярные инстилляции такого раствора, помимо фотосенсибилизирующего и фотопротективного эффекта, опосредованного рибофлавином, оказывают также противоотечное (обезвоживающее) действие на роговицу, сопровождающееся вместе с тем интраоперационным снижением толщины стромы [3]. Это обстоятельство необходимо учитывать при выполнении процедуры УФ-кросслинкинга у пациентов с истонченной роговицей (менее 450 мкм) [4].

    Несмотря на подтвержденную клиническую эффективность, фундаментальные аспекты влияния КЛР на морфологию роговицы, особенно на клеточном и субклеточном уровнях, требуют дальнейшего изучения.

     Цель.

    Комплексное электронно-микроскопическое изучение морфологических изменений роговицы кролика после УФ-кросслинкинга.

     Материал и методы.

    Исследование проведено на 16 роговицах (8 кроликов). Правые глаза животных были опытными (2-я группа), левые — оставались интактными (1-я группа).

    Все манипуляции с животными проведены в соответствии с правилами Локального этического комитета ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России (Приказ № 220 от 30.12.2016) и установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Директива Европейского парламента и Совета Европейского союза 2010/63/ЕС от 22.09.2010 о защите животных, использующихся для научных целей) [5].

    Хирургические вмешательства выполняли в операционной вивария в условиях комбинированной анестезии, включавшей общий наркоз (внутримышечное введение препаратов Золетил/Ксилазин) и местные инстилляции (глазные капли Инокаин). Этап удаления эпителия роговицы проводили с использованием микрохирургического шпателя под контролем операционного микроскопа Carl Zeiss (Германия). Предварительно зона деэпителизации была маркирована метчиком диаметром 7 мм.

    В опытной группе стандартную процедуру КЛР воспроизводили с использованием протектора роговицы ДЕКСТРАЛИНК (0,1% рибофлавина мононуклеотид и 20% декстран Т500) и устройства офтальмологического «УФалинк». Параметры воздействия были следующими: длина волны — 370 нм, мощность УФ-А излучения — 3 мВт/см², продолжительность облучения — 30 мин.

    В послеоперационном периоде проводилась местная антибактериальная терапия путем ежедневных инстилляций препарата Левофлоксацин в течение 3–4 суток (до завершения эпителизации).

    Для морфологического исследования проводили энуклеацию глазных яблок кроликов на 14-е сутки после КЛР роговицы. Глазные яблоки фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Затем их препарировали, выполняя сагиттальный разрез через оптические среды. Полученные образцы проходили стандартную процедуру проводки: обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации, далее заливка в парафиновые блоки. Приготовление гистологических срезов осуществляли на микротоме LEICA RM 2145 (Германия). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином для общего морфологического анализа, а также по методу Ван Гизона — для визуализации соединительнотканных структур роговицы.

    Для электронно-микроскопического исследования образцы тканей фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на какодилатном буфере (pH 7,2–7,4) с постфиксацией в 1% растворе тетроксида осмия. Материал последовательно обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации, заливали в эпон-812. На предварительном этапе готовили полутонкие срезы толщиной 1 мкм, которые окрашивали толуидиновым синим. Ультратонкие срезы получали на ультратоме ЕМ UС 7 (Leica, Германия). Срезы контрастировали последовательно 2% водным раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдсу. Микроскопирование результатов проводились на трансмиссионном электронном микроскопе JEM1011 (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

    Результаты 

    В 1-й группе (контроль) интактная роговица кроликов демонстрировала обычное строение, характерное для данного вида животного, состояла из нескольких плотно прилегающих друг к другу слоев, что хорошо видно на гистологических препаратах (рис. 1).

    Передний многослойный эпителий роговицы состоял из базального, шиповатого и поверхностного слоев, клетки которых соединялись десмосомами (рис. 2 Б). Базальные клетки посредством полудесмосом прикреплялись к Боуменовой мембране (рис. 2 А), состоящей из аморфного вещества и беспорядочно расположенных тонких коллагеновых фибрилл.

    Строма была образована плотно упакованными, строго ориентированными роговичными пластинами,состоящими из параллельных пучков коллагеновых фибрилл. Между пластинами располагались кератоциты веретиновидной формы с развитым гранулярным эндоплазматическим ретикулумом в цитоплазме (рис. 2 В). Задний отдел стромы роговицы ограничивала однородная Десцеметова мембрана, к которой прилегал монослой эндотелиальных клеток со светлой цитоплазмой и округлыми ядрами (рис. 2 Г).

    Во 2-й группе (опыт) восстановление удаленного эпителия наблюдали при биомикроскопии на 3–4-е сутки.

    Ультраструктурный морфологический анализ на 14-е сутки после операции в роговице кролика не выявил значимых изменений в эпителиальном слое, который был представлен многослойным плоским эпителием с четко дифференцируемыми слоями. Базальный слой состоял из клеток призматической формы, которые посредством полудесмосом были плотно прикреплены к базальной мембране. Межклеточные связи обеспечивались десмосомами. Выше располагались 2–3 слоя шиповатых клеток, переходящих в несколько слоев уплощенных поверхностных клеток. Волокнистые структуры Боуменовой мембраны (БМ) были нечеткими, ее некоторые участки по плотности выглядели несколько разнородными (рис. 3 А).

    Кроме того, в строме роговицы отмечали слабо выраженный отек, приводящий к незначительному расслоению роговичных пластин. Однако общая структура и направленность пучков коллагеновых волокон по своему внешнему виду не отличалась от картины, наблюдаемой в интактных роговицах. На ультраструктурном уровне в основном веществе роговицы визуализировались мелкозернистые осмофильные скопления — продукты деструкции матрикса, характеризующиеся плотной цитоплазмой. Их ультраструктура соответствовала типичному строению фибробластических клеток: в цитоплазме присутствовали многочисленные расширенные каналы гранулярной эндоплазматической сети, свободные рибосомы, полисомы, а также овальные митохондрии (рис. 3 Б). В некоторых стромальных зонах отмечалась повышенная плотность кератоцитов.

    Признаки повышенной синтетической активности кератоцитов, которые выражались в гиперплазии гранулярной эндоплазматической сети и обилии рибосом в цитоплазме, могут быть связаны с репаративными процессами, индуцированными в ответ на комбинированное рибофлавин-ультрафиолетовое воздействие с деэпителизацией роговицы. Однако для установления причинно-следственной связи и интерпретации данной морфологической картины требуются дополнительные целенаправленные исследования.

    Кроме того, наблюдали редукцию некоторого количества кератоцитов преимущественно передней стромы, но в части оставшихся клеток ультраструктура основных клеточных органелл сохранялась (рис. 4). В строме выявлялась незначительная инфильтрация сегментоядерными лейкоцитами (рис. 5).

    Структура Десцеметовой мембраны и клеток заднего эпителия не отличались от образцов контрольной группы. Десцеметова мембрана визуализировалась на задней поверхности стромы в виде гомогенной плотной полосы, покрытой монослоем эндотелиальных клеток. Клетки эндотелия имели вытянутую форму, светлую цитоплазму и крупные овальные ядра. В цитоплазме клеток не наблюдались изменения патологического характера.

    Обсуждение

    Проведенное исследование позволило выявить комплекс ультраструктурных изменений в роговице кроликов на 14-е сутки после процедуры КЛР с применением 0,1% рибофлавина и 20% декстрана. Несмотря на клинически подтвержденную эффективность методики, ее применение влечет ряд изменений, в т.ч. патологического характера, в частности, гибель кератоцитов. Вместе с этим КЛР может инициировать процессы ремоделирования в строме, требующие детального морфологического анализа.

    Ключевым объектом воздействия, на который направлен механизм рибофлавин-ультрафиолет-индуцированного сшивания является роговичная строма. В нашем исследовании к 14-м суткам в строме наблюдался слабо выраженный отек и незначительное расслоение роговичных пластин, что согласуется с данными литературы, описывающими послеоперационную воспалительную реакцию [1, 5]. Однако наиболее значимые изменения были выявлены на ультраструктурном уровне. Присутствие в основном веществе стромы мелкозернистых осмофильных скоплений, интерпретируемых как продукты деструкции матрикса, может быть прямым следствием фотохимической реакции кросслинкинга, приводящей к деполимеризации компонентов внеклеточного вещества. Важным аспектом является реакция стромальных кератоцитов на процедуру КЛР. С одной стороны, была отмечена редукция части клеточного пула, что является известным и ожидаемым эффектом в ответ на УФ-сенсибилизированное воздействие [2, 6, 7]. При этом некоторые кератоциты разрушались, а некоторые еще частично сохраняли целостность отдельных внутриклеточных органелл (рис. 4Б), что, возможно, в последующем могло стать причиной индукции апоптоза дефектных клеток [6–9]. С другой стороны, в сохранившихся кератоцитах регистрировались признаки синтетической активности: гиперплазия гранулярного эндоплазматического ретикулума и обилие свободных рибосом и полисом. Это свидетельствует об их активации и участии в репаративных процессах, направленных на перестройку и упрочнение стромального матрикса, после индуцированного воздействия кросслинкингом. Наблюдавшаяся в некоторых зонах повышенная плотность кератоцитов может указывать на начало процессов их репопуляции. Однако для однозначного подтверждения этой гипотезы и изучения механизмов апоптоза и пролиферации требуются дальнейшие исследования с применением иммуногистохимических методов.

    Незначительная лейкоцитарная инфильтрация, выявленная в строме, по всей видимости, является признаком умеренного воспалительного ответа в послеоперационном периоде, связанного с механической деэпителизацией роговицы и ее УФ-облучением. В предыдущих исследованиях было показано, что ранний постоперационный период после КРЛ у пациентов с кератоконусом сопровождался повышением уровня ряда ростовых факторов и провоспалительных цитокинов в слезной жидкости [8].

    Важным исходом КРЛ является отсутствие значимых патологических изменений в переднем эпителии, Боуменовой мембране, а также в Десцеметовой мембране и эндотелии. Сохранность эндотелиальных клеток, как известно, имеет особое физиологическое значение, так как уменьшение их плотности является причиной нарушения гидроосмотической функции роговицы и ее стойкого отека с существенным снижением зрительных функций [10].

    Заключение. 

    Проведенные гистологические и электронно-микроскопические исследования показали, что процедура УФ-кросслинкинга роговицы с использованием 0,1% рибофлавина и 20% декстрана вызывает к 14-м суткам трансформацию стромы, характеризующуюся прямым воздействием на внеклеточный матрикс с признаками последующего его ремоделирования, разнонаправленным ответом кератоцитов, включающим гибель части клеточного пула и одновременную функциональную активацию оставшихся клеток, вызывающих активацию репаративных процессов, умеренной воспалительной реакцией, сохранностью эндотелия и восстановлением ультраструктуры переднего эпителиального барьера.

    Отсутствие выраженных патологических изменений на ультраструктурном уровне подтверждает относительную безопасность использованного протокола УФ-кросслинкинга роговицы.

    Полученные данные вносят вклад в понимание фундаментальных механизмов заживления роговицы после УФ-кросслинкинга, свидетельствуют о необходимости дальнейших исследований методики для оптимизации параметров воздействия, минимизации сопутствующего ультраструктурного ущерба и сокращению сроков восстановления роговой оболочки.

    Информация об авторах

    Бикбов Мухаррам Мухтарамович — д.м.н., проф., директор Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, niipriem@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-9476-8883

    Халимов Азат Рашидович — д.б.н., зав. научно-инновационным отделом Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, azrakhal@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-7470-7330

    Лебедева Анна Ивановна — д.б.н., зав. отделом морфологии Всероссийского центра глазной и пластической хирургии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, jeol02@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-9170-2600

    Мусина Ляля Ахияровна — д.б.н., в.н.с. отдела морфологии Всероссийского центра глазной и пластической хирургии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, morphoplant@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-1237-9284

    Титоян К.Х. — к.м.н., с.н.с. отдела хирургии роговицы и хрусталика Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, oko.ufa@ya.ru, https://orcid.org/0000-0003-3529-3491

    Гилемзянова Л.И. — зав. лабораторией экспериментальных исследований Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, gileisan@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-0583-013x

    Аbout the authors

    Mukharram М. Bikbov — Dr. of Med. Sci., prof., director, Ufa Eye Research Institute, Bashkir State Medical University of the Ministry of Health of Russia, e-mail: niipriem@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-9476-8883

    Azat R. Khalimov — Dr. of Biol. Sci., head of the scientific and innovative department, Ufa Eye Research Institute, Bashkir State Medical University of the Ministry of Health of Russia, e-mail: azrakhal@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-7470-7330

    Anna I. Lebedeva — Dr. of Biol. Sci., head of the morphology department, Russian Center for Eye and Plastic Surgery, Bashkir State Medical University of the Ministry of Health of Russia, e-mail: jeol02@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-9170-2600

    Lyalya A. Musina — Dr. of Biol. Sci., senior researcher at the morphology department, Russian Center for Eye and Plastic Surgery, Bashkir State Medical University of the Ministry of Health of Russia, e-mail: morphoplant@ mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-1237-9284

    Karine Kh. Titoyan — C. of Med. Sci., senior researcher оf the department of corneal and lenticular surgery, Ufa Eye Research Institute, Bashkir State Medical University of the Ministry of Health of Russia, oko.ufa@ ya.ru, https://orcid.org/0000-0003-3529-3491

    Leysan I. Gilemzyanova — head of the laboratory of experimental research, Ufa Eye Research Institute, Bashkir State Medical University of the Ministry of Health of Russia, gileisan@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-0583-013x

    Вклад авторов:

    Бикбов М.М. — концепция исследования, редактирование.

    Халимов А.Р. — сбор и обработка материала, концепция и дизайн исследования, написание текста, редактирование.

    Лебедева А.И. — сбор и обработка материала, написание текста, редактирование.

    Мусина Л.А. — сбор и обработка материала, написание текста, редактирование.

    Титоян К.Х. — написание текста, редактирование.

    Гилемзянова Л.И. — сбор и обработка материала.

    Authors’ contribution:

    Bikbov M.M. — concept of the study, editing.

    Khalimov A.R. — collection and processing of the material, concept and design of the study, writing, editing.

    Lebedeva A.I. — collection and processing of the material, writing, editing.

    Musina L.A. — collection and processing of the material, writing, editing.

    Titoyan K.K. — writing, editing.

    Gilemzyanova L.I. — collection and processing of the material.

    Финансирование. Работа выполнена за счет гранта Российского научного фонда № 24-25-00132, (https://rscf.ru/project/24-25-00132/).

    Financing. The work was funded by the Grant of the Russian Science Foundation No. 24-25-00132, (https://rscf.ru/project/24-25-00132/).

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Conflict of interest: None. .

    Поступила: 27.10.2025

    Переработана: 14.11.2025

    Принята к печати: 19.11.2025

    Received: 27.10.2025

    Revision: 14.11.2025

    Accepted: 19.11.2025