Морфологическое обоснование применения альтернативного аллотрансплантата для офтальмохирургии

    

    Актуальность

    В настоящее время Россия обладает самыми высокотехнологичными методиками в области разработки и внедрения биоматериалов для регенеративной хирургии, а тканевые банки нашей страны могут при необходимости обеспечить практически полное замещение «импорта» в этой стратегически важной медико-социальной сфере [1].

    Как известно, в пластической офтальмохирургии имеются следующие направления: с применением ауто- и аллотканей, а также синтетических материалов. Однако возможности использования для пластики местных тканей, которые хорошо врастают в окружающие ткани, получая достаточное питание, и легко приспосабливаются к новым функциональным условиям, ограничены небольшими размерами дефекта. Направление пластики с использованием синтетических материалов безусловно позитивно сказалось на результатах пластической хирургии. Однако не все варианты такой пластики способны обеспечить сшивание тканей без натяжения, при этом не следует забывать и о возможных серьезных осложнениях (свищи, инфекция, отторжение имплантата и пр.) или недоступности синтетического материала.

    При отсутствии необходимых синтетических материалов или высоком риске выполнения пластики с их использованием, а также невозможности проведения операции с применением местных (перемещенных) тканей, целесообразно рассмотреть вопрос об использовании для этих целей аллотрансплантатов (АТ). Их получают в результате соответствующей физической или химической обработки разных донорских тканей (амниотической мембраны, твердой мозговой оболочки, склеры и т.д.), и они остаются одними из наиболее востребованных биоматериалов для применения в пластической и восстановительно-реконструктивной хирургии, в том числе в офтальмологии. АТ активируют регенеративные процессы, замещаются новообразованной тканью и имеют существенные преимущества в виде биосовместимости, моделируемости и желаемой биомеханики, причем широкое их разнообразие основано на различных методах консервации/стерилизации [2–5].

    Различные разработанные виды биоматериалов «Аллоплант» широко используются в общей, сердечно-сосудистой, пластической, челюстно-лицевой и нейрохирургии, стоматологии, проктологии, гинекологии, а также применяются для акупунктурного введения и в офтальмологии [6].

    Необходимо отметить, что в последние годы, на фоне развития инновационных хирургических методик, спрос на биоматериалы для трансплантации существенно увеличился. Это обусловило необходимость иметь в арсенале хирургов разнообразные альтернативные трансплантаты, в том числе хорошо зарекомендовавшие себя лиофилизированные ткани из широкой фасции бедра (ШФБ) – Fascia lata [7–9]. Кроме того, в настоящее время в офтальмологии стали широко применяться инъекционные формы аллогенных биоматериалов при лечении рубцов век, патологии роговицы глаза (язвы, кератоконус и др.), пигментной дегенерации сетчатки, неврита зрительного нерва, макулодистрофии, хориоретинальных дистрофий различной этиологии, высокой миопии [10–14].

    С учетом возросших потребностей клиник в инъекционных биоматериалах, становится актуальным поиск новых видов соединительной ткани, из которых можно изготавливать диспергированные АТ. С целью подбора необходимой для изготовления диспергированных биоматериалов ткани ранее были проведены комплексные исследования с использованием кадаверной ШФБ.

    Цель

    Морфологическая оценка фиброархитектоники диспергированных АТ, изготовленных из кадаверной ШФБ.

    Материал и методы

    В работе использовались аллогенные биоматериалы: нативные кадаверные ткани ШФБ человека, изготовленные из нее консервированные в 70% спирте и измельченные (диспергированные) – по 10 образцов. Обработка тканей осуществлялась по технологии, разработанной в ВЦГПХ, в частности, диспергированные АТ подвергались физико-химической обработке, высушиванию-лиофилизации, измельчению, фракционированию, радиационной стерилизации.

    Нативные ткани из кадаверной ШФБ фиксировали в 10% растворе забуференного (pH 7,0) по Лилли формалина. После обезвоживания в спиртах фиксированные нативные ткани и консервированные в 70% этаноле АТ заливали в парафин по стандартной методике. Из диспергированных АТ готовили мазки. Парафиновые срезы и мазки окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону и проводили гистохимическую реакцию на выявление гликозаминогликанов (ГАГ) по методу Хейла. Измерение толщины пучков коллагеновых волокон (КВ) и просветов между ними на гистологических препаратах проводили с использованием светового микроскопа AxioImager Z1 при общем увеличении микроскопа ×200 и программы анализа изображений Axiovision (CarlZeiss, Германия).

    При гистохимическом исследовании использовалась полуколичественная оценка полученных результатов (принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски после постановки гистохимической реакции). Парафиновые срезы изготавливали на ротационном микротоме LEICA RM 2145 (LEICA, Германия). Микроскопирование и фотографирование всех окрашенных препаратов производили на микроскопе марки LEICADMD 108 (LEICA, Германия).

    Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы Statistica 6.1. Рассчитывали групповые показатели суммарной статистики – среднюю арифметическую величину (М) и ошибку средней (m). Сравнение данных проводили с помощью параметрического метода t-критерия Стьюдента Различия считались статистически значимыми при р<0,05.

    Результаты и обсуждение

    Гистология нативной кадаверной ткани ШФБ хорошо известна. Сухожильные пластины волокнистой соединительной ткани состоят из плотно упакованных КВ (с удлиненными между ними ядрами фибробластических клеток), которые окрашиваются по Ван Гизону в ярко-красно-оранжевые тона. Фасции трудно растяжимы, поскольку КВ, точнее их пучки, находятся в несколько слоев друг над другом. При этом между ними визуализируются прослойки рыхлой соединительной ткани (ПРСТ). В каждом отдельном слое пучки КВ лежат параллельно друг к другу и ориентированы в одном направлении, которое не совпадает с направлением в соседнем слое. Отдельные солитарные пучки тонких КВ регистрируются связанными между собой при переходе их от одного слоя в другой. Такая структура обеспечивает оптимальные прочностные свойства фасции. Кроме КВ, в ткани фасции есть и тонкие эластические волокна.

    Коллагеновый каркас и тинкториальные свойства ткани после обработки сохранялись полностью, КВ также окрашивались пикрофуксином в ярко-красный цвет (рис. 1, а). При этом клеточные элементы после обработки подвергались полному разрушению, что обусловливает уменьшение иммуногенности АТ (рис. 1, б).

    Микроструктура волокнистого остова консервированных АТ сохранена. Так, КВ в пределах каждого пучка также ориентированы в одном направлении, а волокнистые пучки в разных слоях фасции – под углом друг к другу. Сохраняются ПРСТ между слоями плотно уложенных КВ. На этом фоне, однако, отмечалось существенное уменьшение толщины пучков КВ (варианты 36,64–89,68, в среднем 63,49±14,12) и достоверное увеличение межпучковых пространств (19,78–63,03, в среднем 42,96±10,44) в консервированном АТ ШФБ по сравнению с нативной тканью (89,73–147,72, в среднем 116,44±14,22, и 3,94–21,73, в среднем 10,01±3,56 соответственно). Вероятно, после обработки в АТ происходит слабо выраженное разволокнение пучков КВ, что, однако, не сказывается на качестве конечного продукта – диспергированного биоматериала.

    Гистохимические исследования показали, что в нативной кадаверной ткани ШФБ плотные волокнистые пучки окрашивались преимущественно в синие и голубые тона, что свидетельствует о значительном содержании ГАГ и соответствующей положительной реакции, оцененной нами в ++ (рис. 2, а). Там, где пучки КВ были широкими, преобладало интенсивное окрашивание эозином, хотя ГАГ и определялись в местах разволокнения и рыхлых прослойках между пучками. Это мы оценили как слабоположительную реакцию (+).

    Следует отметить, что в консервированных АТ, изготовленных из ткани ШФБ, после соответствующей обработки ткани содержание ГАГ преимущественно определялось в виде положительной реакции в ++ (рис. 2, б). Только иногда визуализировались небольшие зоны со слабоположительной реакцией (+), где широкие пучки толстых КВ местами окрашивались эозином, а более тонкие волокна между ними – в синий цвет.

    В диспергированных формах АТ, так же как и в образцах нативной ткани и консервированном биоматериале при окраске по Ван Гизону, КВ окрашивались пикрофуксином в ярко-красные тона. Это наглядно свидетельствовало в пользу сохранности их микроструктуры (рис. 3, а). Частицы АТ, окрашиваясь в синий цвет, давали положительную реакцию (++) на высокое содержание в них ГАГ(рис. 3, б).

    Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в диспергированных АТ ШФБ, после прошедшей технологической обработки (состоящей из 5 основных этапов), деструктивных процессов не отмечалось. Сохранение основных свойств нативных и цельных образцов ШФБ, безусловно, может свидетельствовать о сохранности регенеративного потенциала АТ. Важным моментом, является то, что при изготовлении АТ происходит удаление клеточных элементов, ответственных за его иммуногенность на фоне максимального сохранения КВ и ГАГ, играющих весьма значительную роль в процессе регенерации тканей. Таким образом, данные исследования подтвердили желаемое качество диспергированных АТ ШФБ и требования, предъявляемым к готовым образцам АТ из соединительной ткани.

    Заключение

    Технологии физико-химической обработки донорских тканей, измельчения, фракционирования и радиационной стерилизации позволяют сохранять фиброархитектонику ШФБ при изготовлении диспергированных АТ, что важно для регенераторных процессов при их использовании в офтальмохирургии.

    

    Информация об авторах

    Шангина Ольга Ратмировна – доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией консервации тканей, ведущий научный сотрудник, ВЦГПХ ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, Уфа, alloolga@mail.ru, https://orcid/0000-0003-1686-1254

    Мусина Ляля Ахияровна – доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела морфологии ВЦГПХ ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, Уфа, morphoplant@mail.ru, https://orcid/0000-0003-1237-9284

    Хасанов Руслан Алмазович – к.ф.н., ведущий научный сотрудник лаборатории консервации тканей ВЦГПХ ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, Уфа, khrusall@mail.ru, https://orcid/0000-0002-3978-3976

    Information about the authors

    Olga R. Shangina – Doct. of Sci. (Biol.), professor, Head of Tissue Preservation Laboratory, leading researcher, Russian Center for Eye and Plastic Surgery, Bashkir State Medical University of Health of Russia, Ufa, alloolga@mail.ru, https://orcid/0000-0003-1686-1254

    Lyalya А. Musina – Doct. of Sci. (Biol.), leading researcher of the Morphology Department Russian Center for Eye and Plastic Surgery, Bashkir State Medical University of Health of Russia, Ufa, morphoplant@mail.ru, https://orcid/0000-0003-1237-9284

    Ruslan A. Khasanov – Cand. of Sci., leading researcher of Tissue Preservation Laboratory, Russian Center for Eye and Plastic Surgery, Bashkir State Medical University of Health of Russia, Ufa, khrusall@mail.ru, https://orcid/0000-0002-3978-3976

    Вклад авторов

    Шангина О.Р. – существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, консультирование электронно-микроскопических препаратов, написание, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    Мусина Л.А. – сбор, анализ и обработка материала, описание электронно-микроскопических препаратов, написание, редактирование.

    Хасанов Р.А. – сбор, анализ и обработка материала.

    Authors'contributions

    Shangina O.R. – substantial contributions to the conception and design, aquisition, analysis, processing, supervision, writing, final approval of the version to be published.

    Musina L.A. – acquisition, analysis and processing, writing, editing.

    Khasanov R.A. – acquisition, analysis and processing.

    Финансирование: авторы не получали финансирование при проведении исследования и написании статьи.

    Конфликт интересов:отсутствует.

    Funding: the authors received no specific funding for this work.

    Conflicts of interest: none declared.

    Поступила: 28.03.2023

    Переработана: 15.05.2023

    Принята к печати: 25.05.2023

    Originally received: 28.03.2023

    Final revision: 15.05.2023

    Accepted: 25.05.2023