Рис. 1. Фотографии за щелевой лампой (в белом и синем свете). Фотографии глаза в норме (A, B), глаза с признаками секторальной ЛН (C, D) и глаза с признаками полной ЛН (E, F). Эпителий в нормальном глазу прозрачный (A) и не прокрашивается флуоресцеином (B). В глазу с секторальной ЛН при освещении белым светом визуализируется повреждение эпителия в верхнем сегменте сероватого цвета (C). Пораженная зона лучше визуализируется при окрашивании флуоресцеином и освещении синим светом; окрашивание в виде паттерна завитка, флуоресцеин заполняет участки истончения эпителия (D). В глазу с полной ЛН отмечается помутнение всей поверхности роговицы с поверхностной неоваскуляризацией (E). При окрашивании флуоресцеином отмечается нерегулярность эпителия (F)
Рис. 2. Иммуноокрашивание и гистопатологическое окрашивание отпечатков с роговицы. A-C. – Образцы, взятые соответственно с центральной части роговицы, лимба и конъюнктивы нормального трупного глаза. Экспрессия цитокератина-12 обнаруживается только в клетках роговичного эпителия и не выявляется в клетках конъюнктивального эпителия. Экспрессия цитокератина-13 и цитокератина-7 наоборот обнаруживается только в клетках конъюнктивального эпителия. В зоне лимба имеются клетки, позитивные как для цитокератина-12, так и для цитокератинов 13 и 7. D-F. – Образцы, взятые с глаз с ЛН. Клетки, позитивные для цитокератина-13, обнаруживаются в роговице (D). Бокаловидные клетки обнаруживаются при окрашивании Шифф-периодной кислотой (E) или окрашивании Papanicolaou (F) в глазах с ЛН при иммуноокрашивании. Размер бокаловидных клеток (отмечены стрелками) в 2-3 раза больше, чем размер других эпителиальных клеток, внутри клеток видны капли слизи. Капли слизи обычно окрашиваются в розовый цвет при окрашивании Шифф-периодной кислотой
Одной из ключевых характеристик стволовых клеток является их способность к дифференцировке и пролиферации под влиянием рядом расположенной среды – так называемой ниши стволовых клеток (Schofield R., Lane S.W. et al.). Нишами для ЛСК служат палисады Vogt вместе с соответствующими лимбальными сосудами (Davanger M. et al.). Ниши содержат несколько типов вспомогательных клеток, специфический экстрацеллюлярный матрикс и растворимые биохимические медиаторы (Schlotzer-Schrehardt U. et al, Holan V. et al.). Для поддержания нормальной работы ЛСК и сохранения прозрачности роговицы требуется определенный баланс факторов и клеток внутри ниши (Espana E.M. et al., Ahmad S. et al., Polisetti N. et al.). Повреждение ниши при различных заболеваниях, травмах или длительном воспалении ведет к аплазии и истощению ЛСК. В результате способность к регенерации роговичного эпителия утрачивается, и развивается состояние под названием лимбальная недостаточность (ЛН). Стратегия терапии ЛН заключается не только в увеличении количества ЛСК, но и в восстановлении ниш.
Важная роль ЛСК в заживлении роговичных ран и поддержании здоровья роговичного эпителия доказана в многочисленных исследованиях in vitro и на животных моделях (Maumenee A.E. et al., Huang A.J. et al., Chen J.J. et al., Tseng S. et al.). В 1989 году Kenyon K.R. и Tseng S. впервые продемонстрировали, что эпителий роговицы при односторонней ЛН может быть восстановлен путем трансплантации аутологичных ЛСК со второго, здорового глаза. Для билатеральных заболеваний позже была предложена методика аллотрансплантации ЛСК, которая, однако, характеризовалась меньшим процентом успеха в связи с развитием иммунного отторжения (Tseng S. et al., Shortt A.J. et al.). В настоящее время для лечения ЛН используются культивированные аутологичные ЛСК (Pellegrini G. et al., Tsai R.J. et al.).
Благодаря изучению ЛСК произошел значительный прогресс в лечении заболеваний глазной поверхности, и появились новые методики клеточной терапии. За последние три десятилетия было предложено много вариантов трансплантации ЛСК. За период времени с 1980-х годов в литературе опубликовано множество работ, посвященных ЛН, однако в них используются различные термины и различные определения данного состояния (Daya S.M. et al.). В этих сообщениях нет единого мнения касательно стадии заболевания. Вариабельность терминов и представлений о ЛН делают невозможным достоверное сравнение результатов различных методик лечения ЛН.
Для облегчения коммуникации и систематизации данных, Cornea Society (Общество специалистов по лечению заболеваний роговицы) предложило единое определение ЛН, систему классификации и характеристику стадий этого заболевания.
Обществом специалистов по лечению заболеваний роговицы была сформирована рабочая группа, в которую вошли представители Cornea Society, Asia Cornea Society, PanCornea и EuCornea. Все члены рабочей группы имеют большой опыт в лечении заболеваний роговицы и ЛН и являются общепризнанными мировыми экспертами. В процессе многочисленных встреч, телеконференций и email-дискуссий члены рабочей группы обсуждали поставленные задачи до тех пор, пока не был достигнут консенсус в этих вопросах. Предварительные результаты работы были представлены в 2017 году. Наконец, после их свободного обсуждения в кругах специалистов были сформулированы окончательные результаты, представленные в данной статье.
Определение ЛН
ЛН – это заболевание глазной поверхности, обусловленное уменьшением популяции и/или нарушением функции стволовых/прогениторных клеток роговичного эпителия, что ведет к нарушению нормального гомеостаза в эпителии роговицы. Заболевание характеризуется конъюнктивализацией (то есть замещением нормального эпителия роговицы эпителием конъюнктивы) и/или другими признаками дисфункции эпителия, такими как персистирующие или рецидивирующие дефекты эпителия с или без неоваскуляризации, воспалением и рубцеванием глазной поверхности. Частыми проявлениями заболевания являются снижение зрения и дискомфорт, ведущий к снижению качества жизни. ЛН может являться отдельным заболеванием или ассоциироваться с заболеваниями других структур глазной поверхности, включая конъюнктиву, мейбомиевы железы, слезные железы, слезную пленку, нервы роговицы и иммунную систему.
Частичная ЛН характеризуется неполной конъюнктивализацией поверхности роговицы и сохранностью остаточных лимбальных и других клеток эпителия роговицы (рис. 1 А, В). Полная ЛН характеризуется конъюнктивализацией всей поверхности роговицы в связи с полной утратой стволовых/прогениторных клеток роговичного эпителия (рис. 1 C, D).
Классификация ЛН
ЛН развивается по ряду причин (табл. 1). В некоторых случаях причины развития ЛН неизвестны (идиопатическая ЛН).
Приобретенная ЛН
Приобретенная ЛН, не связанная с иммунной системой
Рис. 3. Изображение конфокальной микроскопии in vivo. Конфокальная микроскопия нормальных глаз и глаз с ЛН. A-C. – Изображения нормальных глаз. D-E. – Изображения глаз с ЛН. Нормальные базальные клетки роговичного эпителия (A) имеют четкие яркие границы и гипорефлективную цитоплазму с упорядоченной однородной организацией. Ядра не видны или очень бледные. Суббазальное нервное сплетение (B) и лимбальные ниши (C) четко видны в нормальных глазах. В глазах с тяжелой ЛН базальные клетки роговичного эпителия отсутствуют, суббазальные нервы фрагментированы, а плотность расположения нервов значительно снижена (D). Бокаловидные клетки (отмечены стрелками) определяются в случайном порядке (E). Лимбальные ниши при ЛН не визуализируются, иногда видны воспалительные инфильтраты
Рис. 4. Изображение оптической когерентной томографии переднего отрезка глаза в норме (A-E) и в глазах с ЛН (F-J). В глазах с секторальной ЛН толщина роговичного эпителия в пораженной зоне меньше (G) по сравнению с нормальными глазами (B) и непораженной областью (G); уменьшение толщины соответствует наблюдениям при обследовании за щелевой лампой. На поперечных сечениях, перпендикулярных лимбу виден четкий переход от гипорефлективного роговичного эпителия к гиперрефлективному конъюнктивальному эпителию с утолщением эпителия в области лимба в нормальных глазах (C), но не в глазах с ЛН (H). Лимбальный эпителий в пораженной зоне становится тоньше (H). Лимбальные ниши (отмечены символом «p») и лимбальные крипты (отмечены символом «с») четко визуализируются в нормальных глазах при осмотре в профиль (D) и в параллельных сечениях (E), и отсутствуют в глазах с ЛН (I, J) настоящее время поиск специфических маркеров конъюнктивального эпителия продолжается (Jirsova K. et al., Poli M. et al.).
Хотя точная эпидемиология ЛН не известна, по данным ряда сообщений наиболее частой причиной ЛН являются ожоги роговицы: по крайней мере, две трети трансплантаций ЛСК выполняются по причине ожогов роговицы. Химические ожоги глаз чаще встречаются у мужчин, чем у женщин (Haring R.S. et al.). Химическое и термическое воздействие может приводить к разрушению ЛСК и их ниш. Ишемия более 50% лимба в острую стадию ожога глаз является выраженным фактором риска развития ЛН. Среди химических ожогов чаще встречаются ожоги щелочью, которые характеризуются омылением клеточных мембран и сопровождаются более глубоким проникновением в лимбальную ткань и более выраженным повреждением (Fatima A. et al., LopezGarcia J.S. et al.). Длительное воспаление и денервация глазной поверхности вследствие химических ожогов может способствовать дальнейшему повреждению ЛСК. Термические ожоги глаз встречаются реже, чем химические.
Ношение контактных линз. В литературе встречается термин «кератопатия, индуцированная ношением контактных линз». Точная патофизиология данного состояния неизвестна (Donisi P.M. et al.), однако, по всей вероятности, это заболевание является многофакторным и может быть спровоцировано неправильной посадкой линз, низкой кислородной проницаемостью материала, из которого выполнены контактные линзы, слишком длительным ношением, а также чувствительностью некоторых носителей контактных линз к растворам для хранения и очищения линз. В большинстве случаев ЛН, связанная с ношением контактных линз, является обратимой и исчезает после прекращения ношения линз и медикаментозной терапии.
Хирургия. Глазная хирургия с вовлечением зоны лимба, включая удаление лимбальных или конъюнктивальных опухолей, повторное или избыточное удаление птеригиума (Holland E.J. et al.) или трабекулэктомия с применением антиметаболитов (Pires R.T. at al.) может провоцировать развитие ЛН вследствие прямого разрушения ЛСК и лимбальных ниш. В этих случаях ЛН чаще бывает секторальной. В некоторых публикациях встречается термин «ятрогенная ЛН», то есть ЛН, индуцированная хирургическими вмешательствами или действием медикаментозных препаратов (Holland E.J. et al.).
Токсичность медикаментозных препаратов. Местные лекарственные средства, в частности, митомицин С (Lichtinger A. et al.) и 5-фторурацил (Pires R.T. et al.), консерванты глазных капель (Lin Z. et al.), а также системные химиопрепараты (Ellies P. et al., Kim K. et al.) могут вызывать развитие ЛН.
Буллезная кератопатия. Длительное наличие и далекозашедшая стадия буллезной кератопатии может приводить к ЛН и сквамозной метаплазии (Uchino Y. et al.). После успешной кератопластики признаки ЛН могут уменьшиться.
Другие. ЛН рассматривают как часть патогенеза птеригиума; избыточное удаление птеригиума также может приводить к развитию ЛН. Причиной развития ЛН может являться выраженный микробный кератит, в том числе трахома (Dua H.S. et al.). Потенциальные механизмы развития ЛН вследствие кератита включают тяжелое воспаление глазной поверхности, обусловленный действием инфекции некроз ЛСК, токсичность лекарственных препаратов и прогрессирующее рубцевание после стихания острой стадии воспаления. Хроническая микротравма роговицы поврежденными веками также может приводить к развитию ЛН.
К другим возможным причинам развития ЛН относятся тяжелый розацеа-блефароконъюнктивит (Dua H.S. et al.), сквамозно-клеточный рак глазной поверхности (Lyall D.A. et al.) и облучение (Fujishima H. et al.). В структуре этиологии ЛН эти причины составляют не более 5%.
Приобретенная ЛН, первично связанная с иммунной системой
Синдром Стивена-Джонсона (токсический эпидермальный некролиз). Это довольно редкая группа заболеваний, обусловленная реакцией гиперчувствительности, при которой поражаются кожа и слизистые оболочки, включая глазную поверхность. Первичное поражение ЛСК для синдрома Стивена-Джонсона не характерно. Чаще наблюдается вторичное вовлечение роговицы вследствие продолжительного воспаления глазной поверхности и микротравм (Ma K.N. et al.). Рубцевание протоков слезных и мейбомиевых желез, разрушение бокаловидных клеток конъюнктивы могут приводить к дефициту слезной пленки, что усиливает проявления ЛН.
Рис. 5.Стадии ЛН. В зависимости от тяжести проявлений ЛН выделяют 3 стадии заболевания. При стадии I поражается только периферия роговицы, и в зависимости от степени вовлечения лимба выделяют степени A, B и C (верхний ряд). При стадии II поражается как периферия, так и центральная зона роговицы диаметром 5 мм (средний ряд). При стадии III ЛН поражается вся поверхность роговицы (нижний ряд)
Таблица 1
Аллергические заболевания глазной поверхности
• Весенний кератоконъюнктивит. Пальпебральные и лимбальные формы весеннего кератоконъюнктивита могут сопровождаться развитием ЛН (Samson C.M. et al., Sangwan V.S. et al.). При пальпебральной форме активация фибробластов и гиперпродукция коллагена приводят к гигантской папиллярной гипертрофии, которая сочетается с нарушением состояния глазной поверхности. При лимбальной форме в результате воспаления происходит поражение экстрацеллюлярного матрикса и нарушается поддерживающая функция ниш. Эозинофилы и другие воспалительные клетки вырабатывают токсины, которые также могут повреждать ЛСК (Sangwan VS et al).
• Атопический кератоконъюнктивит. Также, как и при весеннем кератоконъюнктивите к развитию ЛН приводят механическая травма и рубцевание век (Solomon A. et al.). Могут появляться неоваскуляризация и отложение липидных депозитов (Daya S.M. et al.). Воспалительные клетки вырабатывают токсины, которые также могут повреждать ЛСК.
Болезнь «трансплантат против хозяина»
Глазное осложнение, чаще развивающееся после аллогенной трансплантации гематопоэтических стволовых клеток (Dietrich-Ntoukas T et al). Причиной ЛН становятся хроническое воспаление и фиброз в области лимба (Meller D et al). Синдром «сухого глаза» усиливает проявления ЛН.
Наследственная ЛН
Первичные генетические дефекты в таблице 1 включены в группу неизвестной этиологии ЛН.
Врожденная аниридия. Аутосомно-доминантное заболевание связано со спорадической мутацией гена PAX6 и встречается у 1 на 50000-100000 новорожденных. Часто ассоциируется с другими поражениями глаз, такими как глаукома, катаракта, гипоплазия фовеа и зрительного нерва. При рождении функция ЛСК является нормальной, а ЛН развивается во второй декаде жизни и прогрессирует с течением времени (Skeens H.M. et al.).
Эктодермальная дистрофия/дисплазия при аутоиммунной полиэндокринопатии. Аутосомно-рецессивное заболевание, поражающее различные органы, включая паращитовидные железы и эктодермальную ткань (Mohammadpour M. et al., Merenmies L. et al.).
Другие
К редким генетическим нарушениям, сопровождающимся развитием ЛН, относятся пигментная ксеродермия (Fernandes M. et al.), врожденный дискератоз (Aslan D. et al.), синдром кератит-ихтиоз-глухота (Messmer E.M. et al.), буллезный эпидермолиз (Thanos M. et al.) и др.
Диагностика ЛН
Клинические проявления
Симптомы ЛН
На начальных стадиях заболевание может протекать бессимптомно. Основные симптомы ЛН: дискомфорт в глазах, раздражение, ощущение инородного тела, покраснение конъюнктивы, сухость, слезотечение, блефароспазм, боль, фотофобия, снижение зрения и слепота. Эти симптомы ведут к снижению качества жизни.
Клинические признаки ЛН
Клиническими признаками ЛН являются отсутствие нормального фенотипа роговичного эпителия или включения конъюнктивальных эпителиальных клеток (конъюнктивализация). Признаки ЛН обнаруживаются при исследовании за щелевой лампой (особенно верхний сегмент на начальных стадиях заболевания), при окрашивании флуоресцеином и освещении синим светом. В норме между клетками роговичного эпителия имеются плотные контакты, не пропускающие крупные молекулы. При лимбальной недостаточности клетки утрачивают плотные контакты, и проницаемость крупных молекул становится до 40 раз выше (Huang A.J. et al.). При ЛН в на поверхности роговицы можно обнаружить клетки конъюнктивы, метапластические клетки роговичного эпителия и неоваскуляризацию (Sacchetti M. et al., Dua H.S. et al.)(рис. 1 А, В).
ЛН характеризуется особым паттерном окрашивания. Если дефекты эпителия немедленно прокрашиваются флуоресцеином, то при конъюнктивализации краситель просачивается в межклеточные промежутки. Аномальный паттерн окрашивания сохраняется в течение 10 минут и более после закапывания флуоресцеина и сохраняется даже после промывания глаза (Tseng S. et al., Dua H.S. et al.). Выраженность окрашивания варьирует в зависимости от степени тяжести заболевания. Может выявляться отсутствие ниш (Zheng T. et al.). В более продвинутых стадиях аномальный эпителий распространяется от лимба по спиралевидному паттерну, описанному как вихревидная кератопатия, или эпителиопатия в виде завитка (D’Aversa G. et al.) (рис. 1D). В далекозашедших стадиях отмечается субэпителиальный фиброз, фиброваскулярный паннус, рубцевание стромы роговицы, персистирующие или рецидивирующие эпителиальные дефекты и неоваскуляризация (так как эпителий конъюнктивы содержит меньше антиангиогенных факторов, чем эпителий роговицы) (Lim P. et al., Ang A.Y. et al.) (рис. 1 C, D).
Диагностические тесты
Классическими исследованиями при ЛН являются биомикроскопия за щелевой лампой и окрашивание флуоресцеином (Nubile M. et al., Le Q. et al.). Другие методы не являются специфическими, поскольку признаки нарушения эпителия могут быть стертыми. К дополнительным методам обследования при ЛН относятся определение дефицита слезной пленки, неоваскуляризации и кератинизации роговицы, определение отсутствия бокаловидных клеток при цитологии отпечатков и прижизненная конфокальная микроскопия роговицы.
Образцы клеток роговицы для обнаружения конъюнктивальных клеток
Образцы клеток. Цитология соскобов – достаточно инвазивный метод диагностики, может дать точную информацию о поверхностных и глубоколежащих структурах роговицы (Tsubota K. et al.). Интраоперационная биопсия также дает точную информацию о клеточном составе ткани. Цитология отпечатков – менее инвазивный метод, который дает информацию только о поверхностных клеточных слоях (Egbert P.R. et al., Tseng S.C. et al.). Метод был предложен Tseng S. et al. в 1989 г. и является «золотым стандартом» для диагностики ЛН. Отпечаток создается путем прикосновения специальной фильтровальной бумаги к поверхности роговицы под местной анестезией. Оценка клеточных биомаркеров
• Традиционный гистохимический анализ. Окрашивание гематоксилином-эозином или окрашивание Шифф-периодной кислотой позволяет выявить бокаловидные клетки в отпечатке или соскобе с роговицы (рис. 2 D, E). Наличие бокаловидных клеток свидетельствует о конъюнктивализации роговицы. В то же время отсутствие конъюнктивальных клеток в отпечатке роговицы не говорит об отсутствии ЛН (Kim K.H. et al., Ohji M. et al.).
• Иммуногистохимический анализ. Проводится определение внутриклеточных цитокератинов и муцинов (Espana E.M. et al.) (рис. 2 А-C). В настоящее время поиск специфических маркеров конъюнктивального эпителия продолжается (Jirsova K. et al., Poli M. et al.).
• Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией. Это метод обнаружения специфической мРНК конъюнктивальных в отпечатках с роговицы (Garcia I. et al). Метод представляется более чувствительным, чем поиск бокаловидных клеток при иммуноцитологическом исследовании.
Техники визуализации in vivo в диагностике ЛН
• Конфокальная микроскопия in vivo. Метод не требует удаления эпителия и может быть использован как для диагностики, так и для мониторинга ЛН. Клетки эпителия роговицы, конъюнктивы и ЛСК отличаются по своей морфологии (Deng S.X. et al., Araujo A.L. et al.). При конфокальной микроскопии также можно обнаружить и бокаловидные клетки (рис. 3). Другими признаками ЛН при конфокальной микроскопии являются увеличение толщины эпителия, редукция суббазального нервного сплетения и уменьшение плотности базальных клеток (Chan E.H. et al.).
• Оптическая когерентная томография переднего отрезка глаза. Это неинвазивный метод исследования глазной поверхности и лимба. Может дать информацию о толщине эпителия, глубине расположения паннуса, о состоянии лимбальных крипт и об отсутствии лимбальных ниш, а также может позволить отличить гиперрефлективный конъюнктивальный эпителий от гипорефлективного роговичного эпителия (Zakaria N. et al., Voskresenskaya A. et al.) (рис. 4). Оптическая когерентная томография переднего отрезка глаза может дать информацию о сопутствующей патологии глазной поверхности (Atallah M. et al.). В то же время отсутствие лимбальных крипт не является специфическим признаком ЛН, поскольку может наблюдаться в норме у пожилых людей (Zheng T. et al.).
Стадии ЛН в зависимости от клинических признаков
В зависимости от протяженности поражения роговицы и лимба можно выделить 3 стадии ЛН, описанные в таблице 2 и на рисунке 5. Наиболее важными критериями являются вовлечение зрительной оси или зоны в пределах 5 мм от центра роговицы (II и III стадии) и поражение более 50% количества ЛСК. Финальная стадия (стадия III) характеризуется поражением всей поверхности роговицы. Определение стадии процесса необходимо для выбора тактики лечения. Состояние других компонентов глазной поверхности, в том числе конъюнктивы, мейбомиевых желез, слезных желез, роговичных нервов и иммунной системы также могут оказать влияние на тактику терапии. В своей следующей работе авторы планируют представить данные, систематизирующие возможные подходы к лечению ЛН.
Sophie X. Deng, Vincent Borderie, Clara C. Chan et al. Global consensus on definition, classification, diagnosis and staging of limbal stem cell deficiency. Cornea. 2019;38(3): 364–375.
