Некоторые особенности интерпретации результатов конфокальной микроскопии роговицы

    Конфокальная микроскопия нашла широкое применение в офтальмологии, прежде всего для оценки состояния роговицы [1, 2, 6 —10]. Существует несколько типов этих аппаратов – тандемно —сканирующие, щелевые, лазерные. В настоящей работе был использован конфокальный микроскоп с щелевыми полевыми диафрагмами – «Confoscan 4» японской фирмы Nidek, имеющий разрешающую способность 1 мкм. Некоторые преимущества в сравнении с ним имеет аппарат компании Heidelberg Engineering – лазерный конфокальный микроскоп для переднего и заднего отдела HRT 3. Корнеальный модуль этого прибора – RCM (Rostock Cornea Module) – в отличие от других дает возможность исследовать не только центральную зону роговицы, но и все поверхностные структуры, а также передний сегмент глаза [9, 10].

    Тем не менее, при использовании того или иного конфокального микроскопа спорным остается вопрос трактовки изображений, получаемых в ходе обследования пациентов с различной офтальмопатологией. На сегодняшний день существует несколько атласов, созданных зарубежными разработчиками, производителями приборов и отечественными исследователями [2, 10]. Однако анализ литературы и участие в научно —практических конференциях выявили расхождение точек зрения разных ученых в вопросах интерпретации снимков конфокальной микроскопии.

    Цель – проанализировать возможные причины разных трактовок результатов конфокальной микроскопии. На примере изменений после LASIK изучить особенности интерпретации снимков различных слоев роговицы. Оценить перспективы дальнейшего развития данного диагностического метода.

    Материал и методы

    Под наблюдением находилось 22 пациента (44 глаза), из них 19 женщин, 3 мужчин. Средний возраст на момент обследования составил 31 год (от 23 до 39 лет). Всем пациентам был выполнен LASIK по стандартной технологии на установках MEL —60 (Aesculap Meditec, Германия), MEL —80 (Carl Zeiss, Германия) с формированием роговичного лоскута при помощи автоматических микрокератомов LSK Evolution M1, LSK Evolution M2 (Moria, Франция) [3]. До операции пациенты имели миопию различной степени, срок наблюдения был от 4 до 10 лет. Контрольная группа, сопоставимая по количеству, полу и возрасту, состояла из не оперированных добровольцев с эмметропией.

    Для оценки ультраструктуры роговицы использовался щелевой конфокальный микроскоп «Confoscan 4», позволяющий визуализировать послеоперационные изменения на клеточном уровне и проводить пахиметрию различных субслоев с помощью Z —кольца.

    Ранее мы сообщали о выраженном увеличении толщины роговицы через 10 лет после LASIK [4, 13]. Ряд ученых получили схожие результаты в более ранние сроки [11, 14]. В ходе исследования мы измеряли толщину нативных и вновь сформированных слоев роговицы.

    Интерфейс между лоскутом и ложем роговицы распознавался благодаря дебрису, низкой оптической плотности и складкам роговичного лоскута – стриям.

    Отдельно измеряли толщину эпителия и стромы. Оценивали плотность и рефлективность кератоцитов. Подсчитывали плотность эндотелиальных клеток, анализировали их форму и размер. При наличии жалоб на сухость глаз обращали внимание на состояние субэпителиального и суббазального нервных сплетений.

    Результаты и обсуждение

    Типы конфокальных микроскопов различны (лазерные, тандемные, микроскопы с щелевыми полевыми диафрагмами и др.), но для точного послойного измерения толщины роговицы все они требуют контакта датчика с исследуемой поверхностью. При этом наличие иммерсионной среды между роговицей и датчиком, даже при обследовании не оперированной здоровой ткани, зачастую не предотвращает повреждения роговицы (эпителиальные эрозии). Это связано с тем, что сканирование в таком режиме чаще всего проводится автоматически. Кроме того, пациент не всегда адекватно следит за фиксационной меткой.

    В этой связи значения общей толщины роговицы по данным конфокальной микроскопии сильно варьировали от измерения к измерению. Оценка толщины субслоев роговицы могла быть сделана лишь приблизительно, учитывая процентное соотношение общей толщины роговицы и исследуемой зоны. Применение Z —кольца и, соответственно, достаточно длительная аппланация роговицы и ее продавливание в зоне исследования, с нашей точки зрения, определяют разницу значений конфокальной пахиметрии и результатов, полученных с помощью других приборов для измерения толщины роговицы [5]. Достоверные значения толщины эпителия могли быть получены только при хорошей фиксации пациентом метки и в отсутствии боковых движений Z —кольца, которые часто вызывают эпителиальные эрозии.

    Гиперрефлективность и утолщение нервных волокон субэпителиального и суббазального нервного сплетения в разные сроки после LASIK, которые были выявлены нашими исследованиями и рядом отечественных и зарубежных авторов, могут являться показателем активного регенерационного процесса [12]. Тем не менее, толщина и количество поперечных связей между нервными волокнами с большей достоверностью, чем рефлективность, отличали нормальную нервную ткань от находящейся в процессе восстановления.

    У всех пациентов после LASIK, независимо от времени, прошедшем после операции, в той или иной степени определялись высокорефлективные кератоциты – «стрессовые» клетки. По данным литературы, плотность кератоцитов прогрессивно уменьшается от передней части стромы к задней [2, 10]. В нашем исследовании рефлективность кератоцитов была одинакова высокой по всей толще стромы, что, возможно, является признаком продолжающего восстановительного процесса.

    С другой стороны, существуют разные точки зрения на оценку рефлективности кератоцитов. Нет единого мнения о том, что означает гиперрефлективность – активный метаболический процесс, апоптоз кератоцитов, погрешность метода и т.д. Отметим, что при использовании конфокального микроскопа с щелевыми диафрагмами достаточно трудно визуализировать прозрачную боуменову и десцеметову мембраны. Однако при фокусировке на них светового луча микроскопа может происходить сильное светорассеяние, что приведет к значительному увеличению рефлективности кератоцитов, нервных волокон и клеток Лангерганса, находящихся вблизи этих мембран.

    При исследовании эндотелия здоровых добровольцев и пациентов после LASIK патологических изменений выявлено не было. Прежде всего, нами проводилась визуальная оценка плеоморфизма и полимегетизма эндотелиальных клеток. При представлении результатов конфокальной микроскопии эти параметры не менее значимы, чем плотность эндотелиальных клеток. В частности, этот параметр у одного пациента может сильно отличаться при проведении нескольких повторных исследований. При этом прибор чаще всего оценивает не более 50 клеток, что, с нашей точки зрения, недостаточно для того, чтобы делать вывод о состоянии тысяч клеток, находящихся на одном квадратном миллиметре роговицы. В связи с этим визуальная оценка состояния эндотелия и сравнение парных глаз с определением на исследуемом участке процентного соотношения гексагональных клеток и клеток, имеющих атипичную форму, а также их размера, представляется важным диагностическим этапом.

    Выводы

    1. Конфокальная микроскопия роговицы открывает широкие возможности для научных исследований. Тем не менее, отсутствие стандартизации подходов к интерпретации результатов замедляет внедрение метода в клиническую практику.

    2. Применение конфокальной микроскопии для изучения структуры различных слоев роговицы после LASIK позволяет оценивать ответ оперированной ткани на вмешательство, в том числе в отдаленном послеоперационном периоде.

    3. Дальнейшее накопление опыта использования конфокальной микроскопии при различных видах офтальмопатологии, а также проведение мультицентровых исследований позволит выработать единый подход к трактовке снимков, получаемых с помощью данного диагностического метода.