
Рис. 1. Схема экспериментальной установки: 1 – микроскоп, 2 – проточная камера, 3 – держатель препарата роговицы, 4 – препарат роговицы, 5 – поток PBS

Рис. 2. Типичный график флуоресценции красителя Calcein при повышении температуры среды с 25° С до 37° С в эндотелиальных клетках препаратов роговицы свиньи. Оси: абсцисс – секунды, ординат – относительный объем
Цель
Определить потенциальную возможность диагностики функциональной сохранности трансплантатов роговицы человека на основе исследования транспорта воды и ионов натрия клетками эндотелия роговицы свиньи.
Материал и методы
Исследование проводилось на дисках роговицы свиньи диаметром 8,0 мм (трепанация через 6-8 часов после забоя животных), сохраняемых при 4° С во влажной камере и в консервационной среде Eusol-C (Alchimia, Италия).
Исследование относительного объема клетки. Для изучения изменений объема клетки применяли метод, основанный на эффекте гашения флуоресцентного красителя Calcein белками цитоплазмы [14].
Кратко: загрузка клеток красителем (Calcein AM, Sigma, Германия) производилась в среде L-15 Leibovitz с конечной концентрацией Calcein AM 10 мкM, DMSO 1%. Время инкубации 15 минут при 37° С. Установка собрана на микроскопе AxioVert 40 (Zeiss, Германия). Для регистрации флуоресценции использовали комплект фильтров Zeiss #09, объектив х40 n.a. 0,5. Проточную камеру микроскопа и растворы термостатировали при 25° С или 37° С.
Эмитируемый свет регистрировали с помощью фотоприемника на основе ФЭУ-71, оборудованного полевой диафрагмой для измерения интенсивности флуоресценции в интересующей группе клеток. Измерения производили с помощью цифрового осциллографа АСК-3102 (Актаком®, Россия) с записью на компьютер.
Ранее нами было показано, что изменения относительной флуоресценции (F/F0) линейно пропорциональны изменениям относительного объема клеток (V/V0) [15]. Изменения объема клетки выражали в относительных величинах флуоресценции.
Исследование содержания внутриклеточного натрия. Клетки эндотелия загружали красителем 5,0 μM Sodium Green AM (Molecular Probes, США) при 37° С 30 мин, затем помещали в проточную камеру микроскопа (рис. 1) в изотоническом растворе фосфатно-солевого буфера (PBS: 138 мM NaCl, 4,7 мM Na2HPO4, 2,7 мM KCl, 1,5 мM KH2PO4, 0,5 мM MgCl2, 5,5 мM глюкоза, 0,1 мМ CaCl2) с нормальной концентрацией натрия и уравновешивали в течение минимум 60 сек. Флуоресценцию клеток эпителия регистрировали с помощью описанной выше установки. Динамику изменения внутриклеточной концентрации натрия в клетках эндотелия записываличерез 6-8 часов после забоя животных и после гипотермической консервации (4° C) препаратов роговицы глаза длительностью 2, 6 и 12 суток.
Для оценки достоверности различий независимых выборок применяли t-критерий Стьюдента. Все величины выражены как M±σ, n – количество препаратов роговицы.
Результаты и обсуждение
Основным источником энергии для векторного транспорта ионов является Na/К-АТФаза, создающая градиент электрохимического потенциала натрия на плазматической мембране клеток, что является вторичным источником энергии для выполнения клетками эндотелия функции «насоса» [7, 16]. В настоящей работе мы исследовали регуляцию относительного объема эндотелиальных клеток в результате температурной активации Na/K-ATФазы. Выведение ионов натрия из клетки приводило к снижению клеточного объема, что регистрировали по снижению флуоресцентного сигнала красителя Calcein. В препарате роговицы свиньи (6-8 часов после забоя животных), помещенном в изотонический раствор PBS, снижение клеточного объема при повышении температуры с 25 до 37° С происходит с характерным временем 34,8±1,3 с (n=4). Эти данные указывают на интенсивные процессы регуляции клеточного объема, поскольку в охлажденной, деполяризованной клетке устанавливается равновесная со средой концентрация ионов.
Снижение объема клетки при температуре 37° С в основном связано с выведением из клеток эндотелия ионов натрия. Мы провели исследование динамики выхода натрия из клетки с помощью специфического для натрия флуоресцентного красителя Sodium Green. Согласно полученным результатам, скорость снижения относительного клеточного объема на начальном этапе можно оценить, как -3×10-3±10-5 с-1 (n=4) (рис. 2). Скорость снижения относительной концентрации внутриклеточного натрия меньше, но близка по порядку величины, что согласуется с предположением о значительном влиянии натрия на изменение клеточного объема (-7×10-4±10-6 с-1) (n=5). Таким образом, динамика внутриклеточной концентрации натрия может являться параметром, отражающим жизнеспособность и функциональную активность клеток эндотелия трансплантата роговицы.
Из приведенных графиков (рис. 3) можно видеть, что длительная (6 суток и более) холодовая консервация значительно снижает интенсивность выведения натрия из клетки, что в сочетании с повышением проницаемости плазматической мембраны для этого иона ведет к установлению более высокого стационарного уровня внутриклеточного натрия в клетках эндотелия, как это было показано нами ранее [Батурина и др., 2018].
Выводы
Исследование динамики снижения клеточного объема эндотелия роговицы, а также содержания внутриклеточного натрия в клетках эндотелия при холодовой консервации дает объективное представление о транспортной компетентности этих клеток и сохранности консервированной роговицы.
Работа поддержана бюджетным проектом № 0324-2019-0041 и грантами Российского фонда фундаментальных исследований № 17-04-00328, № 19-08-00874 А.