Новые свойства препарата ОКОВИДИТ как протектора офтальмопатологии и осложнений COVID-19, развивающихся с участием TRPV 1-рецепторных каналов

    В связи с возникшими в последнее время угрозами новых тяжелых вирусных заболеваний и их последствий ведутся активные поиски физиологических механизмов, участвующих в развития соответствующих патологических процессов и разработка патогенетически направленного лечения с использованием новых лекарственных средств.

    В качестве одной из потенциальных мишеней патогенеза вирусных патологий легких и других органов (включая ткани глаза, обонятельную и другую рецепцию) при COVID-19 рассматриваются мембранные рецепторы ионных каналов семейства TRP (Transient Receptor Potential Channels).

    TRP каналы включают 6 субсемейств TRPV-рецепторных каналов (TRPV 1-6). TRPV1 – это большое суперсемейство мембранных рецепторов, способных формировать неселективные катонные каналы, которые могут активироваться разнообразными стимулами (температура, рН, растяжение и др.), а также химическими лигандами (анандамид, АТФ, NH3, полиамины, ПКС и др.) Будучи активированы, TRPV1 проводят преимущественно ток ионов кальция в клетку, избыточное поступление которого при гиперактивации TRPV1 играет основную роль в клеточных нарушениях, вызвая деполяризацию, выброс индукторов альгезии и воспаления (Brito R. et al., 2014). В настоящее время наибольшая плотность TRPV1 выявлена на нервных окончаниях болевых, обонятельных, легочных и других сенсорных афферентов периферической нервной системы. Доказано их активное участие в инициации температурной/болевой гипералгезии при активации сенсорных болевых или температурных афферентов в периферической системе. Однако TRPV1 описаны и в других клетках и тканях, вплоть до нейронов и синапсов ЦНС (Brito et al., 2014).

    Установлено, в частности, что TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 локализованы в роговице, а TRPV1, TRPV2, TRPV5 и TRPV6 представлены и в сетчатке (Leonelli M. et al; 2009, Pan Z, et al; 2008) . В ходе работ было показано, что суперсемейство TRP каналов играет решающую роль в регулировании глазного гомеостаза и патогенезе различных заболеваний. TRPV 1 каналы вовлечены в регулирование регенеративных, защитных и сенсорных механизмов роговицы. Повреждения роговичного эпителия, вызванные активацией TRPV1 каналов, ведут к воспалению, образованию рубцов и потере прозрачности роговицы. Соответственно, TRPV1 каналы являются потенциальной мишенью для лечения синдрома сухого глаза, так как подавление их активности может уменьшить воспаление поверхностных структур глаза (Zhang F., et al., 2007). Активация TRPV1 рецепторных каналов в клетках эпителия роговицы индуцирует выброс провоспалительного агента интерлейкина-6 и интерлейкина-8 (Wang Z.et al., 2011). Получены данные об участии семейства TRPV каналов в развитии глаукоматозных патологических изменений ганглиозных элементов сетчатки. Подавление активности TRPV и, особенно, TRPV1 каналов, представленных во всех глазных структурах, может способствовать торможению ряда патологических процессов в роговице и сетчатке (Wienderholt M. et.al , 2000).

    Наряду с клетками глаза, TRPV 1- рецепторные каналы широко представлены и в нервных окончаниях легочных афферентов, а также - в нервных окончаниях волокон обонятельной луковицы (Dong H.-W. et al., 2012) .

    В новостях интернет-ресурса аrХiv представлен препринт работы (Maaroufi H., 2021) , доказывающей, что S-белок в составе вируса SARS-CoV-2S содержит домены, которые могут взаимодействовать с доменами , входящими в состав молекулы TRPV-рецепторов. Участие TRPV 1-рецепторов в нарушениях обонятельных, вкусовых и других хеморецепторов уже доказано. Отсюда нельзя исключить, что, именно вследствие структурного взаимодействия сайтов S-белка вируса и участков в молекуле TRPV 1-каналов вирус осуществляет запуск TRPV-зависимых патологических процессов в разных видах хеморецепции. Соответственно, препараты, блокирующие активность TRPV 1- рецепторных каналов, могут оказаться эффективным средством защиты против таких взаимодействий и нарушений, вызываемых COVID- 19 (Maaroufi H., 2021).

    В недавнем обзоре А.Nahama c соавторами впервые высказано предположение, что одной из причин смертности при тяжелых легочных повреждениях при COVID-19 может быть повышенная активность TRPV1-каналов в окончаниях легочных афферентов и легочного тракта ( Nahama A. et al., 2020 ). Доказано, что активация этих каналов - обязательный участник механизма передачи болевых сигналов, процессов воспаления и иммуномодуляции в легочной системе ( Preti D. et al., 2012) . По мнению авторов обзора (Nahama A. et al., 2020), выглядит весьма вероятным, что терапевтические воздействия, мишенью которых будут TRPV1-каналы нервных окончаний афферентных волокон в составе легких, смогут купировать воспалительные и иммунные процессы в легких (предотвращая выброс про-цитокинов в легких и протектируя развитие ОРДС при COVID-19).

    Нельзя исключить, что аналогичные воздействия – то есть фармакологическая блокада TRPV1-каналов в нервных окончаниях, в роговице и других клетках глаза, обонятельных и других структур, тормозя избыточную активность TRPV1, которая, предположительно, может возникать как первичная патология при инфицировании вирусом, может оказаться полезной для профилактики и начальных стадий лечения нарушений обоняния и воспалительных процессов в глазах, носовых ходов и легких.

    В связи с тем, что TRPV-рецепторы являются уникальными универсальными интеграторами физических и химических стимулов, сопровождающих различные повреждающие воздействия на клетки (Brito R. et al., 2014), ведутся активные поиски избирательных антагонистов TRPV1 рецепторов. Известен целый ряд природных модуляторов TRPV1 из числа трав, животных токсинов, например - камфора, токсины, анемоны и других, но успехи в их лечебном использовании пока минимальны.

    В связи с этим , весьма перспективной, но остающейся без должного внимания является субстанция, которая, по предварительным данным, также способна эффективно подавлять TRPV1-каналы ( Mironova E. et al., 2013; 2017). Это - экстракт ламинарии (Laminaria saccharina), который содержит большой спектр физиологически активных веществ. Возможное участие этого уникального природного «коктейля» в подавлении активности TRPV1-каналов до сих пор не изучалась. Сухой экстракт морской водоросли ламинарии - основное действующее вещество лекарственного средства - геля Оковидит. Данный препарат уже используется в офтальмологии, однако, возможно, недоисследован с точки зрения его лечебных свойств как блокатора TRPV1-рецепторов и протектора вирусных инфекций типа COVID-19.

    В связи с этим, целью данной работы было изучение влияния экстракта морской бурой водоросли ламинарии на Са-проводящую активность TRPV1- рецепторных каналов, экспрессированных и встроенных в мембрану клеток линии СНО .

    Материалы и методы

    В работе использовали экстракт морской бурой водоросли ламинарии Laminaria saccharina (Экстракт входит в качестве основного действующего вещества препарата Оковидит - трансдермального лекарственного средства, улучшающего регенерацию тканей глаза и способствующего лечению глазных заболеваний, в частности, кератопатий различного генеза (Э.М. Миронова с соавт., 2020).

    В эксперименте действие экстракта ламинарии изучали на стабильной линии клеток CHO, после экспрессии в них белок-рецептор крысы TRPV1 (rTRPV1). Данная линия была получена с использованием T-REx System (Invitrogene). кДНК, кодирующая rTRPV1, была клонирована в индуцируемый экспрессирующий вектор pcDNA4/TO. Полученной конструкцией были трансформированы клетки CHO, несущие регуляторный вектор DNA6/TR, экспрессирующий тетрациклиновый репрессор. Отбор трансформантов проводился с использованием селективных антибиотиков (Blasticidin (5 μg/ml) и zeocin (250 μg/ml)). Экспрессия TRPV1 индуцировалась добавлением тетрациклина в клеточную среду (1μg/ml) за 24 часа до тестирования. Отбирались и использовались моноклоны с наибольшим уровнем экспрессии TRPV1 .

    Флуоресцентный анализ проводился с использованием планшетного спектрофотометра с интегрированной автоматической системой дозирования жидкостей NOVOstar (BMG LABTECH). Клетки, экспрессирующие рецептор rTRPV1, рассевались на 96-луночный планшет (75000 клеток на лунку), культивировали ночь при 37°C и 5% СO2 в полной среде DMEM без антибиотиков, содержащей 1 µg/ml тетрациклина в качестве индуктора. Далее клетки прокрашивались Са2+-чувствительным флуоресцентным зондом (Fluo-4) с использованием Fluo-4 Direct™ Calcium Assay Kit (Invitrogene), инкубировались при 37°C в течение 60 мин и при 25°C в течении 60 мин. Исследовалось изменение клеточной флюоресценции (λex=485 nM, λem=520 nM) до и после стимуляции клеток агонистом TRPV1 - капсаицином (400 нМ) в присутствии различных концентраций экстракта морской водоросли. Измерения проводились при pH 7.4 и 37°C.

    Результаты исследования

    В эксперименте при аппликации разведенного сухого экстракта ламинарии на клетки культуры линии СНО с экспрессированным рецептором TRPV1 была выявлена способность экстракта подавлять клеточную флуоресценцию Са-чувствительного зонда, запускаемую аппликацией капсаицина на клетки линии СНО. Наибольшая активность была установлена при действии экстракта в концентрции 4-5 мг/мл, вызывавшая значительное - на 30-50% - подавление флюоресценции, что может означать ингибирование входа Са и формирование Са2+ сигнала, развивающегося в клетках при однократной активации клеток капсаицином (400 нМ). Таким образом, экстракт морской водоросли проявлял значительную ингибирующую активность по отношению к Са-сигналам, формируемым в клетках СНО в ответ на действие на них капсаицина .

    Учитывая данные литературы о том, что основным проявлением активности TRPV1 каналов является проведение ионов кальция в клетки под действием агониста капсаицина (Brito R. et al., 2014), есть основания предполагать, что экстракт ламинарии вызвал подавление активности TRPV1-каналов клеток, вход по ним кальциевого тока в клетки, что и привело к подавлению отслеживаемого флюоресцентным зондом Са-сигнала .

    Полученные результаты позволяют предположить, что воздействие разведенного сухого экстракта ламинарии может быть препаратом , эффективно блокирующим TRPV-1 каналы, то есть предотвращающим активирующее действие на каналы агониста капсаицина и, тем самым, блокирующим капсаицин-индуцируемый вход Са по TRPV1 каналам.

    Естественно предположить, что аналогичным действием может обладать и препарат Оковидит, основным действующим веществом которого является тот же сухой экстракт морской бурой водоросли ламинарии.

    Экстракты бурых водорослей - фукуса и ламинарии - хорошо изучены и включает чрезвычайно богатый спектр биологически активных веществ, в первую очередь – полисахариды (альгиновую кислоту, ламинарин, маннитол, фукоидан и др.) а также - минералы (в первую очередь - компоненты органического иода, магний, калий, кальций железо), аминокислоты и другие вещества. На этом основании экстракты лиминарии широко используются в настоящее время в качестве пищевых биодобавок и косметологических средств, а также - природных антиоксидантов и бактерицидных средств ( Patra J. et al., 2015) . Однако мы не нашли в мировой литературе данных о способности экстракта ламинарии подавлять активность TRPV1-каналов: такая активность экстракта выявлена нами впервые.

    На наш взгляд, нельзя исключить аналогичный механизм действия у трансдермального препарата Оковидит, представляющего собой гель, легко проникающий через кожу благодаря вспомогательному компоненту -полиэтиленгликолю (ПЭГ). Можно предположить, что трансдермальная аппликация Оковидита могла бы - помимо уже известных лечебных свойств препарата - приводить к снижению активности TRPV-1-рецепторных каналов в тканях и нервных окончаниях зрительного анализатора, подавлению там патологических процессов, связанных с активностью TRPV1-рецепторов (как это уже обсуждается в случае использования блокады TRPV1 при поражениях легких, обонятельных и вкусовых рецепторов при COVID-19) (Nahama A. et al., 2020, Maaroufi H., 2021).

    Согласно рекомендациям ВОЗ, возможно назначение препаратов с предполагаемой этиотропной эффективностью «off-label» (то есть использование с медицинской целью, не соответствующей инструкции по медицинскому применению). При этом их назначение должно соответствовать этическим нормам, рекомендованным ВОЗ, и осуществляться на основании законодательства и нормативных документов Российской Федерации. В текущих условиях распространения новой короновирусной инфекции и ограниченности доказательной базы по лечению COVID-19, использование препаратов «off-label» для оказания медицинской помощи пациентам с COVID-19 базируется на международных рекомендациях, а также согласованных экспертных мнениях, основанных на оценке степени пользы и риска при использовании терапии в режиме «off-label». (Рекомендации Минздрава РФ, 2020). В связи с этим, нанесение безопасного и эффективного препарата Оковидит с профилактической или лечебной целью возможно не только на кожу век, но и на кожу в области носа (ноздри и кончик носа) для защиты от вирусных воздействий в этих зонах.

    В любом случае, полученные нами приоритетные данные впервые показывают, что сухой экстракт бурой водросли ламинарии и Оковидит (как носитель сухого экстракта ламинарии), предположительно, могут выступать не только как кератопротекторы, но и как нейропротекторы при различных видах офтальмопатологии. Кроме того, существует возможность использования препарата Оковидит для профилактики и лечения КОВИД-19 и его осложнений. Данные литературы и результаты собственных исследований (Э.М. Миронова, 2013, 2017, 2020) могут служить подтверждением данного предположения, которое требует дальнейшего более детального исследования.