Новые возможности экспресс-диагностики сложно культивируемых возбудителей инфекционных кератитов

    

    Актуальность

    Широта этиологического спектра инфекционного кератита [1] представляет серьезную проблему в диагностике данного заболевания, так как большинство используемых в клинической практике аналитических методик оказываются неэффективными в выявлении сложно культивируемых и атипичных возбудителей данного заболевания. Между тем помутнения роговицы, возникающие после инфекционного кератита вследствие неадекватной терапии, могут привести к потере зрения, делая необходимым разработку новых диагностических подходов.

    На данный момент в диагностике кератитов широко применяются классические микробиологические методы исследования, такие как различные методы окраски и посев на питательные среды. Окрашивание позволяет получить результаты быстро, однако для данного метода существуют определенные недостатки. Агрессивная пробоподготовка может повредить значимые микроорганизмы, а отсутствие специфических красителей (что особенно актуально в отношении атипичных возбудителей) существенно ограничивает эффективность этого метода. Также стоит упомянуть ограничения оптических приборов, не позволяющих подробно оценить морфологию изучаемых объектов.

    Посев на питательные среды может довольно точно определить возбудителя заболевания, однако время получения результатов анализа может занимать от нескольких дней до нескольких недель. К тому же для роста некоторых микроорганизмов, в том числе и атипичных возбудителей инфекционных процессов, требуются особые температурные или биохимические условия, не включенные в стандартные протоколы. Более того, существуют микроорганизмы, которые и вовсе не культивируются на известных питательных средах.

    В настоящее время все шире применяются высокотехнологичные методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и метагеномный анализ. Однако ПЦР, несмотря на свою высокую чувствительность, обладает относительно низкой специфичностью, что может приводить к ложноположительным результатам. К тому же перед проведением анализа клиницисту необходимо выбрать определенную панель с довольно ограниченным перечнем патогенов для исследования, в результате чего микроорганизмы, не типичные для инфекции определенной локализации, могут быть пропущены.

    Существует быстрый и точный метод диагностики – метагеномный анализ на различных секвенаторах. Однако стоимость анализа даже одного образца довольно велика, а также не исключается возможность получения большого количества ложноположительных результатов, хотя требования к лабораториям, осуществляющим метагеномный анализ, очень высоки.

    В настоящее время в Российской Федерации разрабатывается метод диагностики, который потенциально может решить проблему с атипичными возбудителями. Этот метод предполагает использование инновационного красителя на основе редкоземельных металлов лантаноидов, который позволяет мгновенно окрашивать клинические образцы [2]. Суправитальная схема лантаноидного контрастирования предусматривает то обстоятельство, что одноклеточный организм при окрашивании вовлекает в свой метаболизм тяжелые лантаноиды и депонирует их в определенных локациях. Области, маркированные тяжелыми лантоноидами, обладают повышенной яркостью на изображениях в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ). При этом от момента поступления пробы в лабораторию до получения первого изображения проходит не более 20 мин. Стоит отметить, что суправитальное экспресс-окрашивание нативного образца предполагает идентификацию на СЭМ клинически значимых микроорганизмов, т.е. именно тех, которые вызывают инфекционный процесс.

    Уже показано эффективное использование метода окрашивания лантаноидами в исследованиях механизмов дистрофических заболеваний роговицы [3, 4], а также при визуализации бактерий конъюнктивы [5], микробного сообщества системы слезоотведения [6] и роговичного микробиома в норме [7].

    Цель

    Демонстрация применения метода лантаноидного контрастирования и СЭМ в диагностике сложно культивируемых возбудителей инфекционных кератитов, не выявляемых в рамках стандартного бактериологического посева на питательные среды.

    Материал и методы

    В данной статье мы описываем два случая инфекционного кератита, этиологию которого не удалось установить с помощью стандартного бактериологического исследования.

    В первом клиническом случае представлен пациент М., 37 лет, который через 2 недели после кераторефракционной операции LASIK на правом глазу (ОD) отметил покраснение, рези, белесоватое отделяемое. Он обратился к офтальмологу, где был поставлен диагноз: ОD – инфекционный кератит. С момента установления диагноза пациенту проводилась местная терапия, включаящая антисептики (Picloxydine), антибиотики (Moxifloxacin, Azithromycin), противогрибковые препараты (Fluconazole), нестероидные противоспалительные препараты (Bromfenac) и глюкокортикостероиды (Betamethasone), а также системный противогрибковый препарат (Terbinafine). Лечение продолжалось один месяц, однако положительная динамика отсутствовала.

    Во втором клиническом случае представлен пациент Г., 78 лет, с диагнозом: ОD – первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) II стадии, компенсированная на местном гипотензивном режиме (Brinzolamidum, Travoprost). В течение 3 месяцев пациент отмечал слезотечение, покраснение, ощущение инородного тела и дискомфорт на правом глазу. Он обратился к офтальмологу с появлением резких болей и резей в правом глазу, и ему был поставлен диагноз: ОD – инфекционный кератит. Было проведено лечение локальными антисептиками (Picloxydine), антибиотиками (Tetracycline) в течение трех недель без положительной динамики.

    Для проведения импрессионной пробы и ее визуализации с использованием СЭМ с лантаноидным контрастированием у пациентов было получено добровольное информированное согласие на проведение исследования и взят биологический материал путем забора образца с глазной поверхности (ГП) стерильным гибким полистироловым носителем. Носитель с адгезированными микробными и эпителиальными клетками обрабатывали реактивами из набора для контрастирования BioREE-B в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя (ООО «Глаукон», Россия). Затем данный носитель закрепляли на предметном столике и размещали в камере сканирующего электронного микроскопа EVO LS 10 (Zeiss, Германия). Наблюдения проводили в режиме низкого вакуума при ускоряющем напряжении 21 кВ и токе на образце 60–320 пА. Использовали детектор обратно-рассеянных электронов (BSE).

    У пациента, представленного в клиническом случае № 1, импрессионную пробу для проведения визуализация посредством СЭМ с лантаноидным контрастированием проводили спустя 1 месяц после начала лечения, у второго пациента – спустя 3 недели после начала лечения.

    Микробиологическое исследование для верификации возбудителя инфекционного процесса у представленных пациентов осуществляли при первичном обращении к офтальмологу в соответствии со стандартными протоколами бактериологического исследования [8], предусматривающими выделение чистых культур микроорганизмов на питательных средах в температурном режиме +37 °С с их последующей идентификацией.

    Результаты

    На изображении, полученном при проведении СЭМ с лантаноидным контрастированием, у пациента № 1, были выявлены однотипные палочковидные микроорганизмы, с умеренным удлинением, без образования спор, с четкими контурами внешних оболочек, без жгутиков, без полярных депозитов и корд фактора. Также было отмечено присутствие связывающего бактериальные клетки матрикса (биопленки) (рисунок, а). После получения визуальных данных о присутствии биопленкообразующих бактериальных клеток на ГП, антимикробная терапия пациента была усилена антибиотиком Imipenem, обладающего активностью против бактерий ГП, способных формировать биопленку [9]. В результате инфекционный процесс был купирован.

    При этом у пациента, представленного в клиническом случае № 1, стандартное бактериологическое исследование показало наличие Staphylococcus epidermidis. Известно, что этот микроорганизм зачастую является виновником контаминации микробиологической пробы [10]. Это позволило предположить, что такой результат стандартного бактериологического анализа оказался ложноположительным. В пользу этого предположения говорит и то, что пациент не отвечал на стандартную антимикробную терапию, о чем было сказано в разделе «Материалы и методы».

    У пациента, представленного в клиническом случае № 2, при проведении СЭМ испрессионной пробы с лантаноидным контратированием, были выявлены овальные крупные клетки, по размеру соответствующие грибковым (рисунок, б). После получение визуальных данных к местному лечению был добавлен антимикотический препарат (Fluconazole), и была достигнута стабилизация процесса. При этом у пациента, представленного в клиническом случае № 2, стандартное бактериологическое исследование оказалось неинформативным: этиологический агент обнаружен не был.

    Таким образом, положительная динамика в состоянии ГП после корректировки терапии по результатам импрессионной пробы позволяет сделать вывод о том, что стандартное бактериологическое исследование в клинических случаях оказалось неинформативным для установления этиологического агента, а оптимальный подход к лечению пациентов был определен с использованием информации, полученной при проведении СЭМ с лантаноидным контрастированием.

    Обсуждение

    По морфологическим признакам микроорганизм, идентифицированный с помощью СЭМ и лантаноидного контрастирования, в первом случае был схож с биопленкообразующими представителями рода Moraxella, которые известны как атипичный возбудитель тяжелых поражений глаза [11]. Характерной особенностью данного возбудителя является то, что представители рода Moraxella растут и размножаются в относительно низкотемпературных условиях, что объясняет отсутствие этих микроорганизмов в результатах стандартного посева.

    Фенотипические признаки, обнаруженные с помощью СЭМ и лантаноидного контрастирования во втором клиническом случае, позволили предположить, что возбудителем инфекционного кератита являлся гриб рода Cladosporium. В пользу этого свидетельствует то, что оптические изображения его отдельных клеток морфологически полностью соответствуют изображениям, полученным на СЭМ. Для идентификации грибковой инфекции требуются специальные питательные среды, что объясняет отсутствие этих микроорганизмов в результатах стандартного посева.

    Можно предположить, что присутствие атипичных возбудителей в представленных клинических случаях объясняется особым статусом ГП у наших пациентов. Постоянный контакт поверхности роговицы с окружающей средой, а также ее бессосудистый статус требуют лишь незначительного ухудшения иннервации и трофики для возможного появления жизнеспособных микроорганизмов с отличным от стандартных условием культивирования. Такой статус ГП может возникнуть в случае кераторефракционных вмешательств [12], как у пациента № 1, при глаукоме [13], как у пациента № 2, или при состояниях, приводящих к нейротрофическому кератиту. Исходя из этого, можно рекомендовать метод лантаноидного контрастирования и СЭМ для верификации возбудителей в случаях кератита, возникающего у пациентов с отягощенным анамнезом в отношении трофического статуса ГП.

    Стоит также отметить, что разрешение электронного микроскопа не лимитировано особенностями световых оптических приборов, а определяется пределом в сканирующем микроскопе, что позволяет использовать совершенно новые морфометрические данные для дифференциальной диагностики таких инфекций. В настоящий момент ведутся работы по отработке метода экспресс-диагностики возбудителей инфекционных заболеваний с привлечением возможностей машинного обучения для экспресс-диагностики, что поможет масштабировать применение СЭМ с лантаноидным контрастированием.

    Заключение

    Использование лантаноидного контрастирования и сканирующего электронного микроскопирования позволило обнаружить возбудителей, которые не выявлялись при стандартных бактериологических исследованиях. Было показано, что СЭМ с лантаноидным контрастированием можно рекомендовать как один из инструментов диагностики сложно культивируемых возбудителей инфекционных кератитов. Особенно актуальным этот метод становится для пациентов, гомеостаз ГП которых может быть нарушен вследствие существующих сопутствующих заболеваний, ухудшающих ее трофику.

    Представленные данные свидетельствуют о потенциале лантаноидного контрастирования и СЭМ в качестве дополнительного инструмента для идентификации атипичных возбудителей и определения оптимального подхода к лечению кератита у пациентов с особым статусом ГП.

    

    Информация об авторах

    Кравчик Марина Владимировна – кандидат медицинских наук, младший научный сотрудник ФГБНУ «НИИ глазных болезней им. М.М. Краснова», Москва, kravchik.mv@gmail, https://orcid.org/0000-0001-5764-4198

    Зайцев Алексей Владимирович – кандидат медицинских наук, научный сотрудник ФГБНУ «НИИ глазных болезней им. М.М. Краснова», Москва, al.zayceff@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-1599-5138 Каспарова Евгения Аркадьевна – кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник ФГБНУ «НИИ глазных болезней им. М.М. Краснова», Москва, kasparova_jane@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-0534-1536

    Родина Елизавета Cергеевна – аспирант ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, Москва, rodina.elizavet4@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-5525-1793

    Суббот Анастасия Михайловна – кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник ФГБНУ «НИИ глазных болезней им. М.М. Краснова», Москва, kletkagb@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-8258-6011

    Новиков Иван Александрович – старший научный сотрудник ФГБНУ «НИИ глазных болезней им. М.М. Краснова», Москва, i.novikov@niigb.ru, https://orcid.org/0000-0003-4898-4662

    Information about the authors

    Marina V. Kravchik – Candidate of Medical Sciences, Junior Researcher at the M.M. Krasnov Research Institute of Eye Diseases, Moscow, kravchik.mv@gmail, https://orcid.org/0000-0001-5764-4198

    Alexey V. Zaitsev – Candidate of Medical Sciences, Researcher at the M.M. Krasnov Research Institute of Eye Diseases, Moscow, al.zayceff@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-1599-5138

    Evgeniya A. Kasparova – Candidate of Medical Sciences, Leading Researcher at the M.M. Krasnov Research Institute of Eye Diseases, Moscow, kasparova_jane@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-0534-1536

    Elizaveta S. Rodina – assistant during the First Moscow State Medical University named after I.M. Sechenov, Moscow, rodina.elizavet4@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-5525-1793

    Anastasia M. Subbot – Candidate of Medical Sciences, Senior Researcher at the M.M. Krasnov Research Institute of Eye Diseases, Moscow, kletkagb@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-8258-6011

    Ivan A. Novikov – Senior Researcher at the M.M. Krasnov Research Institute of Eye Diseases, Moscow, i.novikov@niigb.ru, https://orcid.org/0000-0003-4898-4662

    Вклад авторов

    Кравчик М.В. – cбор и обработка материала, написание текста.

    Зайцев А.В. – сбор и обработка материала.

    Каспарова Евг.А. – сбор и обработка материала.

    Родина Е.С. – сбор и обработка материала.

    Суббот А.М. – концепция исследования.

    Новиков И.А. – концепция исследования, редактирование текста.

    Authors'contributions

    Kravchik M.V. – collecting and processing material, writing text.

    Zaitsev A.V. – collection and processing of material.

    Kasparova Evg.A. – collection and processing of material.

    Rodina E.S. – collection and processing of material.

    Subbot A.M. – research concept.

    Novikov I.A. – research concept, text editing.

    Финансирование: авторы не получали финансирование при проведении исследования и написании статьи.

    Конфликт интересов: отсутствует.

    Funding: the authors received no specific funding for this work.

    Conflicts of interest: none declared.

    Поступила: 07.07.2023.

    Переработана: 21.07.2023.

    Принята к печати: 03.08.2023

    Originally received: 07.07.2023

    Final revision: 21.07.2023

    Accepted: 03.08.2023