Онлайн доклады

Онлайн доклады

Клинические случаи в офтальмологии

Клинические случаи в офтальмологии

Впервые выявленная глаукома: проблемы и возможности

Впервые выявленная глаукома: проблемы и возможности

Пироговский офтальмологический форум 2023

Пироговский офтальмологический форум 2023

Сателлитные симпозиумы в рамках Пироговского офтальмологического форума 2023

Сателлитные симпозиумы в рамках Пироговского офтальмологического форума 2023

Сателлитные симпозиумы в рамках III Всероссийской конференции с международным участием «Воспаление глаза 2023»

Сателлитные симпозиумы в рамках III Всероссийской конференции с международным участием «Воспаление глаза 2023»

Проблемные вопросы глаукомы: Искусственный интеллект в диагностике и мониторинге XII Международный симпозиум

Проблемные вопросы глаукомы: Искусственный интеллект в диагностике и мониторинге XII Международный симпозиум

Сателлитные симпозиумы в рамках 23-го Всероссийского научно-практического конгресса с  международным участием «Современные технологии  катарактальной, рефракционной и роговичной хирургии»

Сателлитные симпозиумы в рамках 23-го Всероссийского научно-практического конгресса с международным участием «Современные технологии катарактальной, рефракционной и роговичной хирургии»

NEW ERA Способы трансcклеральной фиксации ИОЛ

NEW ERA Способы трансcклеральной фиксации ИОЛ

Сателлитные симпозиумы в рамках XVI Российского общенационального офтальмологического форума

Сателлитные симпозиумы в рамках XVI Российского общенационального офтальмологического форума

Ромашка Фёдорова: 35 лет в движении. Всероссийская научно-практическая конференция

Ромашка Фёдорова: 35 лет в движении. Всероссийская научно-практическая конференция

Сателлитные симпозиумы в рамках Северо-Кавказского офтальмологического саммита

Сателлитные симпозиумы в рамках Северо-Кавказского офтальмологического саммита

NEW ERA Новые молекулы в лечении макулярной патологии

NEW ERA Новые молекулы в лечении макулярной патологии

Сателлитные симпозиумы в рамках XXIX Международного офтальмологического конгресса «Белые ночи»

Сателлитные симпозиумы в рамках XXIX Международного офтальмологического конгресса «Белые ночи»

Сателлитные симпозиумы в рамках Всероссийской научно-практической конференции с международным участием  «Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия»

Сателлитные симпозиумы в рамках Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия»

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Сателлитные симпозиумы в рамках 20 Всероссийской научно-практической конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии»

Сателлитные симпозиумы в рамках 20 Всероссийской научно-практической конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии»

NEW ERA Особенности имплантации мультифокальных ИОЛ

NEW ERA Особенности имплантации мультифокальных ИОЛ

XXX Научно-практическая конференция офтальмологов  Екатеринбургского центра МНТК «Микрохирургия глаза»

XXX Научно-практическая конференция офтальмологов Екатеринбургского центра МНТК «Микрохирургия глаза»

Прогрессивные технологии микрохирургии глаза в реальной клинической практике. Научно-практическая конференция

Прогрессивные технологии микрохирургии глаза в реальной клинической практике. Научно-практическая конференция

Пироговский офтальмологический форум

Пироговский офтальмологический форум

Глаукома. Избранные вопросы патогенеза, профилактики, диагностики, лечения. Всероссийская офтальмологическая конференция

Глаукома. Избранные вопросы патогенеза, профилактики, диагностики, лечения. Всероссийская офтальмологическая конференция

Терапия глаукомы. Практический подход и поиск решений в дискуссии

Терапия глаукомы. Практический подход и поиск решений в дискуссии

NEW ERA Хирургическое лечение глаукомы: НГСЭ

NEW ERA Хирургическое лечение глаукомы: НГСЭ

Сателлитные симпозиумы в рамках 22-го Всероссийского научно-практического конгресса «Современные технологии катарактальной, рефракционной и роговичной хирургии»

Сателлитные симпозиумы в рамках 22-го Всероссийского научно-практического конгресса «Современные технологии катарактальной, рефракционной и роговичной хирургии»

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ - 2022

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ - 2022

Современные достижения лазерной офтальмохирургии Всероссийский научный симпозиум

Современные достижения лазерной офтальмохирургии Всероссийский научный симпозиум

Юбилейная X научно-практическая конференция, посвященная 35-летию Чебоксарского филиала ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова»

Юбилейная X научно-практическая конференция, посвященная 35-летию Чебоксарского филиала ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова»

NEW ERA Хирургия осложнённой катаракты

NEW ERA Хирургия осложнённой катаракты

NEW ERA Оптическая когерентная томография. Критерии активности макулярной неоваскуляризации

NEW ERA Оптическая когерентная томография. Критерии активности макулярной неоваскуляризации

NEW ERA Особенности лечения отслойки сетчатки

NEW ERA Особенности лечения отслойки сетчатки

Шовная фиксация ИОЛ

Мастер класс

Шовная фиксация ИОЛ

Сателлитные симпозиумы в рамках I Дальневосточного офтальмологического саммита

Сателлитные симпозиумы в рамках I Дальневосточного офтальмологического саммита

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Восток - Запад 2022 Международная конференция по офтальмологии

Восток - Запад 2022 Международная конференция по офтальмологии

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Вебинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Новые технологии в офтальмологии 2022

Новые технологии в офтальмологии 2022

ОКТ: новые горизонты

Сателлитный симпозиум

ОКТ: новые горизонты

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Вебинар

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Вебинар компании «Rayner»

Вебинар компании «Rayner»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Вебинар

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Сателлитный симпозиум

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Вебинар

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

XIX Конгресс Российского глаукомного общества  «19+ Друзей Президента»

XIX Конгресс Российского глаукомного общества «19+ Друзей Президента»

Пироговский офтальмологический форум

Пироговский офтальмологический форум

Кератиты, язвы роговицы

Вебинар

Кератиты, язвы роговицы

Актуальные вопросы офтальмологии

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Сателлитный симпозиум

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Клинические случаи в офтальмологии

Клинические случаи в офтальмологии

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Впервые выявленная глаукома: проблемы и возможности

Впервые выявленная глаукома: проблемы и возможности

Сателлитные симпозиумы в рамках Пироговского офтальмологического форума 2023

Сателлитные симпозиумы в рамках Пироговского офтальмологического форума 2023

Пироговский офтальмологический форум 2023

Пироговский офтальмологический форум 2023

Сателлитные симпозиумы в рамках III Всероссийской конференции с международным участием «Воспаление глаза 2023»

Сателлитные симпозиумы в рамках III Всероссийской конференции с международным участием «Воспаление глаза 2023»

Проблемные вопросы глаукомы: Искусственный интеллект в диагностике и мониторинге XII Международный симпозиум

Проблемные вопросы глаукомы: Искусственный интеллект в диагностике и мониторинге XII Международный симпозиум

Сателлитные симпозиумы в рамках 23-го Всероссийского научно-практического конгресса с  международным участием «Современные технологии  катарактальной, рефракционной и роговичной хирургии»

Сателлитные симпозиумы в рамках 23-го Всероссийского научно-практического конгресса с международным участием «Современные технологии катарактальной, рефракционной и роговичной хирургии»

NEW ERA Способы трансcклеральной фиксации ИОЛ

NEW ERA Способы трансcклеральной фиксации ИОЛ

Сателлитные симпозиумы в рамках XVI Российского общенационального офтальмологического форума

Сателлитные симпозиумы в рамках XVI Российского общенационального офтальмологического форума

Ромашка Фёдорова: 35 лет в движении. Всероссийская научно-практическая конференция

Ромашка Фёдорова: 35 лет в движении. Всероссийская научно-практическая конференция

Сателлитные симпозиумы в рамках Северо-Кавказского офтальмологического саммита

Сателлитные симпозиумы в рамках Северо-Кавказского офтальмологического саммита

NEW ERA Новые молекулы в лечении макулярной патологии

NEW ERA Новые молекулы в лечении макулярной патологии

Сателлитные симпозиумы в рамках XXIX Международного офтальмологического конгресса «Белые ночи»

Сателлитные симпозиумы в рамках XXIX Международного офтальмологического конгресса «Белые ночи»

Сателлитные симпозиумы в рамках Всероссийской научно-практической конференции с международным участием  «Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия»

Сателлитные симпозиумы в рамках Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия»

Все видео...

Новый патогенетический механизм дегенерации сетчатки при ВМД – экструзия фоторецепторов


Рис. 1. Органоид сетчатки человека, воспроизводящий некоторые характеристики человеческой сетчатки. (а) Схема. Поколение ОСЧ, структура сетчатки и типы клеток, определенные количественно на (b, c) иммуноокрашенных серийных срезах ОСЧ: колбочки (ARR3); палочки (NRL); МГ (SOX9, RLBP1). (с) Графики: кружки представляют отдельные ОСЧ (n), полученные из N=4 независимых экспериментов, n ≥ 5/N; среднее значение ± стандартное отклонение по n. (d) Анализ по Вороному: количество соседних колбочек, проанализированных по анфас изображениям цельных препаратов ОСЧ, иммуноокрашенных для маркеров колбочек (ARR3), фоторецепторов (RCVRN) и глии Мюллера (SLC1A3+RLBP1) (дополнительные рис. 3a – e, k; N = 1; n = 8; среднее значение±стандартное отклонение по n; усреднено 3 ROI/n). (e) Сканирующая электронная микроскопия ОСЧ показала образование внутреннего (ВСФ) и внешнего (НСФ) сегментов фоторецептора (N = 1, n = 6). (f) Опсиновое иммуное окрашивание срезов ОСЧ (N = 1; n = 9): палочки (RHO) и колбочки (OPN1LW/MW, OPN1SW). (g) Анализ последовательностей РНК отдельных клеток ОСЧ: точечный график показывает кластеры клеток после обнаружения кластера Лувена во встраивании UMAP. Круговая диаграмма: относительное количество основных типов клеток в индивидуальной ОСЧ. Точечный график/круговая диаграмма: псевдоцвет для указанных типов клеток. Фоторецепторы (светло-розовые): вероятно, незрелые колбочки, но их нельзя четко определить. (h) Сравнение данных РНКсеквенции одной клетки: распределение корреляции Пирсона клеток ОСЧ и эталонных данных о фовеа и периферии сетчатки человека. График скрипки: корреляция Пирсона колбочек, палочек и глии Мюллера в ОСЧ (N = 1) по сравнению с эталонными векторами человека (значения корреляции трех отдельных доноров-людей (N = 3), объединенных в один график скрипки; дополнительный рисунок 3g: данные индивидуального донора). Коробчатые диаграммы: минимум, 1-й квантиль, медиана, 3-й квантиль, максимальные значения, точки представляют собой точки данных с выбросами (нижний диапазон: 25-й процентиль – 1,5	 a	 IQR; верхний диапазон: 75-й процентиль + 1,5	a	IQR; IQR: межквартильный диапазон). (i) Анатомическая макула человека: фото глазного дна (в возрасте 28 лет) и схема сетчатки. График: плотность макулярных колбочек и стержней у людей in vivo. Стрелки: соотношение колбочек и стержней, воспроизведенное в HRO; распространенное место возникновения AMD / MDD 9 110. Масштабные линейки: b 1 мм, c 50 мкм, e 10 мкм (вставка 1 мкм), f 10 мкм. График: плотность макулярных колбочек и палочек у людей in vivo. Стрелки: соотношение колбочек и палочек, воспроизведенное в ОСЧ; распространенное место возникновения ВМД/МДЗ
Рис. 1. Органоид сетчатки человека, воспроизводящий некоторые характеристики человеческой сетчатки. (а) Схема. Поколение ОСЧ, структура сетчатки и типы клеток, определенные количественно на (b, c) иммуноокрашенных серийных срезах ОСЧ: колбочки (ARR3); палочки (NRL); МГ (SOX9, RLBP1). (с) Графики: кружки представляют отдельные ОСЧ (n), полученные из N=4 независимых экспериментов, n ≥ 5/N; среднее значение ± стандартное отклонение по n. (d) Анализ по Вороному: количество соседних колбочек, проанализированных по анфас изображениям цельных препаратов ОСЧ, иммуноокрашенных для маркеров колбочек (ARR3), фоторецепторов (RCVRN) и глии Мюллера (SLC1A3+RLBP1) (дополнительные рис. 3a – e, k; N = 1; n = 8; среднее значение±стандартное отклонение по n; усреднено 3 ROI/n). (e) Сканирующая электронная микроскопия ОСЧ показала образование внутреннего (ВСФ) и внешнего (НСФ) сегментов фоторецептора (N = 1, n = 6). (f) Опсиновое иммуное окрашивание срезов ОСЧ (N = 1; n = 9): палочки (RHO) и колбочки (OPN1LW/MW, OPN1SW). (g) Анализ последовательностей РНК отдельных клеток ОСЧ: точечный график показывает кластеры клеток после обнаружения кластера Лувена во встраивании UMAP. Круговая диаграмма: относительное количество основных типов клеток в индивидуальной ОСЧ. Точечный график/круговая диаграмма: псевдоцвет для указанных типов клеток. Фоторецепторы (светло-розовые): вероятно, незрелые колбочки, но их нельзя четко определить. (h) Сравнение данных РНКсеквенции одной клетки: распределение корреляции Пирсона клеток ОСЧ и эталонных данных о фовеа и периферии сетчатки человека. График скрипки: корреляция Пирсона колбочек, палочек и глии Мюллера в ОСЧ (N = 1) по сравнению с эталонными векторами человека (значения корреляции трех отдельных доноров-людей (N = 3), объединенных в один график скрипки; дополнительный рисунок 3g: данные индивидуального донора). Коробчатые диаграммы: минимум, 1-й квантиль, медиана, 3-й квантиль, максимальные значения, точки представляют собой точки данных с выбросами (нижний диапазон: 25-й процентиль – 1,5 a IQR; верхний диапазон: 75-й процентиль + 1,5 a IQR; IQR: межквартильный диапазон). (i) Анатомическая макула человека: фото глазного дна (в возрасте 28 лет) и схема сетчатки. График: плотность макулярных колбочек и стержней у людей in vivo. Стрелки: соотношение колбочек и стержней, воспроизведенное в HRO; распространенное место возникновения AMD / MDD 9 110. Масштабные линейки: b 1 мм, c 50 мкм, e 10 мкм (вставка 1 мкм), f 10 мкм. График: плотность макулярных колбочек и палочек у людей in vivo. Стрелки: соотношение колбочек и палочек, воспроизведенное в ОСЧ; распространенное место возникновения ВМД/МДЗ
    Авторами работы был создан органоид сетчатки, воспроизводящий несколько ее структурных и функциональных свойств с целью моделирования сложных патологических комбинаций в фоторецепторах и глии.

    При использовании такой модели было показано, что комбинированного применения молекул TNF и HBEGF достаточно, чтобы вызвать дегенерацию фоторецепторов и выраженные патологические изменения в глии, дисламинацию и образование рубцов, которые развиваются одновременно и постепенно как один сложный фенотип. Гистологические, транскриптомные, визуализационные (live-imaging) и механистические исследования позволили выявить ранее неизвестный патологический механизм: нейродегенерация фоторецепторов посредством их экструзии. Это может быть актуальным для возрастных изменений, ВМД и некоторых наследственных заболеваний сетчатки.

    Фармакологические ингибиторы механосенсора PIEZO1, MAPK и актомиозина предотвращают патогенез, тогда как активатор PIEZO1 индуцирует экструзию фоторецепторов. Описываемая экспериментальная модель демонстрирует механистическое
Рис. 2. Комбинированное применение TNF и HBEGF вызывает дегенерацию фоторецепторов в ОС. (а) Схема: исследованы изменения фоторецепторов. НТ вызывает дегенерацию колбочек (ARR3) и палочек (NRL), включая смещение эктопических клеток выше наружной пограничной мембраны (НПМ) (обозначена желтой пунктирной линией) и потерю клеток. (b) Изображения в светлом поле: обработанные НТ и контрольные ОСЧ в культуре. (c) Иммуноокрашенные серийные срезы ОСЧ использовали для определения состава клеток сетчатки: количество клеток, положительных на ARR3 и NRL в НТ-ОСЧ, по сравнению с контролем (количество маркерных+ клеток на 100 мкм; дополнительные данные 2; контрольные данные частично представлены на рис. 1с). (d) Резюме: НТ-индуцированные изменения состава клеток сетчатки (количество маркерных+ клеток) на общее количество клеток (ядер, DAPI). Контрольные данные на основе рис. 1с: колбочка и палочка; рис. 4: данные МГ; сравнение с рис. 1h. Серая фракция: все остальные клетки, не помеченные тремя использованными маркерами. (e) Анализ состава клеток: проточная цитометрия обработанных НТ и контрольных ОСЧ. Диссоциированные клетки ОСЧ разделяли на две фракции для анализа: иммуноокрашенные на маркеры колбочек (ARR3) и фоторецепторов (RCVRN) или маркеры колбочек (ARR3) и МГ (SOX9). Изображения: визуализирующий проточный цитометрический анализ (DAPI, ядра). (e1, e2) Графики: данные проточной цитометрии. (e3) Схематическая диаграмма: состав клеток НТ-ОСЧ. Цифры в скобках: кратность изменения НТ-ОСЧ по сравнению с контролем. Цвета, как показано на (d). (f) Проточная цитометрия окрашивания живым красителем Calcein и (g) окрашивание TUNEL на криосрезах. (h, i) Анализ иммуноокрашивания маркера фоторецептора RCVRN на серийных срезах ОС: показывает эктопические (выдавленные) фоторецепторы за пределами НПМ и (h, i) патологические изменения и потерю RCVRN- и митохондриально-позитивных (мито) внутренних сегментов фоторецепторов (ВСФ). Нитевидный актин: визуализируется Phalloidin488 (PD) для определения НПМ/апикальной границы. (c, e–i) графики (среднее значение±стандартное отклонение) и статистика по n. Двусторонний критерий Стьюдента; **Р<0,0001, *Р=0,0023. (c, g–i) графики: каждый кружок представляет один ОСЧ (n), полученный из N=4 с n ≥ 5/N; 2 линии иАСКч (дополнительные данные 2). (e) Графики: каждый кружок представляет один набор (н) из 6–9 объединенных ОСЧ (2-3н/N, N = 3, 2 линии иПСКч). (f) Графики: каждый кружок представляет клетки, проанализированные из одного образца (о); два объединенных ОСЧо/о; N = 1 независимый эксперимент. (e, f) Среднее ± стандартное отклонение и статистика по выборкам
Рис. 2. Комбинированное применение TNF и HBEGF вызывает дегенерацию фоторецепторов в ОС. (а) Схема: исследованы изменения фоторецепторов. НТ вызывает дегенерацию колбочек (ARR3) и палочек (NRL), включая смещение эктопических клеток выше наружной пограничной мембраны (НПМ) (обозначена желтой пунктирной линией) и потерю клеток. (b) Изображения в светлом поле: обработанные НТ и контрольные ОСЧ в культуре. (c) Иммуноокрашенные серийные срезы ОСЧ использовали для определения состава клеток сетчатки: количество клеток, положительных на ARR3 и NRL в НТ-ОСЧ, по сравнению с контролем (количество маркерных+ клеток на 100 мкм; дополнительные данные 2; контрольные данные частично представлены на рис. 1с). (d) Резюме: НТ-индуцированные изменения состава клеток сетчатки (количество маркерных+ клеток) на общее количество клеток (ядер, DAPI). Контрольные данные на основе рис. 1с: колбочка и палочка; рис. 4: данные МГ; сравнение с рис. 1h. Серая фракция: все остальные клетки, не помеченные тремя использованными маркерами. (e) Анализ состава клеток: проточная цитометрия обработанных НТ и контрольных ОСЧ. Диссоциированные клетки ОСЧ разделяли на две фракции для анализа: иммуноокрашенные на маркеры колбочек (ARR3) и фоторецепторов (RCVRN) или маркеры колбочек (ARR3) и МГ (SOX9). Изображения: визуализирующий проточный цитометрический анализ (DAPI, ядра). (e1, e2) Графики: данные проточной цитометрии. (e3) Схематическая диаграмма: состав клеток НТ-ОСЧ. Цифры в скобках: кратность изменения НТ-ОСЧ по сравнению с контролем. Цвета, как показано на (d). (f) Проточная цитометрия окрашивания живым красителем Calcein и (g) окрашивание TUNEL на криосрезах. (h, i) Анализ иммуноокрашивания маркера фоторецептора RCVRN на серийных срезах ОС: показывает эктопические (выдавленные) фоторецепторы за пределами НПМ и (h, i) патологические изменения и потерю RCVRN- и митохондриально-позитивных (мито) внутренних сегментов фоторецепторов (ВСФ). Нитевидный актин: визуализируется Phalloidin488 (PD) для определения НПМ/апикальной границы. (c, e–i) графики (среднее значение±стандартное отклонение) и статистика по n. Двусторонний критерий Стьюдента; **Р<0,0001, *Р=0,0023. (c, g–i) графики: каждый кружок представляет один ОСЧ (n), полученный из N=4 с n ≥ 5/N; 2 линии иАСКч (дополнительные данные 2). (e) Графики: каждый кружок представляет один набор (н) из 6–9 объединенных ОСЧ (2-3н/N, N = 3, 2 линии иПСКч). (f) Графики: каждый кружок представляет клетки, проанализированные из одного образца (о); два объединенных ОСЧо/о; N = 1 независимый эксперимент. (e, f) Среднее ± стандартное отклонение и статистика по выборкам
понимание гипотезы невропатологий, которое можно использовать для разработки новых методов лечения, способных предотвратить потерю зрения, в том числе путем регенерации сетчатки у пациентов, страдающих ВМД и другими дистрофиями сетчатки.

    Введение

    Нейродегенеративные заболевания, вызывающие потерю зрения, представляют собой огромное бремя для общественного и личного здоровья. Возрастная макулярная дегенерация связана с комплексом факторов риска и является частью группы макулярных дегенеративных заболеваний, наследственных дистрофий сетчатки, вызываемых различными мутациями с вариабельными фенотипами.

    Экспериментальные модели животных расширяют наше понимание о природе заболеваний, но у большинства из них отсутствует макула и проявляются лишь некоторые черты дегенераций сетчатки. В частности, сложные фенотипы сетчатки при прогрессирующей ВМД (географическая атрофия) и некоторых других дистрофий до сих пор не решены, поскольку данные свидетельствуют о том, что дегенерация фоторецепторов (ФР), которая может быть вызвана или сопровождаться атрофией ретинального пигментного эпителия и сосудист
Рис. 3. Обработка TNF и HBEGF вызывает экструзию клеток фоторецепторов и дефекты внутреннего сегмента фоторецепторов (ВСФ). (а) Прижизненная визуализация ОСЧ. (b) Дифференциальный интерференционный контраст. (c) Конфокальная микроскопия с вращающимся диском. (b, c) НТ-ОСЧ и контроли (КОНТРОЛЬ) живут в культуре. Мечение ядер клеток SiR-ДНК живым красителем (остро применяется для визуализации). (b) Анфас изображение: эктопические ядра появились через 5 дней в НТ-ОСЧ на их поверхности, но не в контроле (оптическая плоскость расположена на уровне ВСФ). Независимые эксперименты: n = 10 ОСЧ (дополнительные данные 3). (с) Серия изображений поперечного сечения из дополнительного фильма 3: ядра клеток выходят за пределы апикальной границы органоида на его поверхность (желтая линия). Ядра клеток наружной сетчатки кажутся круглыми в контроле и до экструзии, а во время экструзии временно приобретают форму песочных часов. Независимые эксперименты с n = 8 ОСЧ (дополнительные данные 3). (d) НТ-ОСЧ по сравнению с КОНТРОЛЕМ, проанализированные с помощью сканирующей (СЭМ) электронной микроскопии (ЭМ) (1-2, 1’-2’), трансмиссионной (TЭМ) ОСЧ, залитых эпоксидной смолой (3, 5, 3’, 5 ‘-6’) и корреляционная световая электронная микроскопия (КЛЭМ) ультратонких криосрезов (4, 4’): окрашивание RCVRN (фоторецепторы, P), SLC1A3 (глия Мюллера, MG и DAPI (экструдированные (*) ядра клеток), визуализируется с помощью иммунофлуоресценции и золотых частиц (черные точки, золото 10 нм). N = 1 независимый эксперимент (N) с n=3 (TЭМ) и n = 5 (СЭМ) проанализированных ОСЧ (n). (e 1–5) Серия изображений TЭМ: фоторецепторы (P, зеленый псевдоцвет) во время или после экструзии (10-дневная НТ). Клеточные соединения (НПМ): отмечены красным. Ядро фоторецептора: звездочка. Двойная звездочка: мертвое ядро (e5). (е 6–9) КСЭМ НТ-ОСЧ (e6, e7: 10-дневная НТ; e8, e9: 20-дневная НТ), иммуномеченая для RCVRN (e6, 7) или ARR3 (e8, 9), и DAPI подтверждает, что фоторецепторы выдавливаются. (e6) Экструдированные клетки (звездочки) и (e7) фоторецептор в процессе продавливания через НПМ, обозначенный ядром в форме песочных часов и положением клеточных соединений (белая пунктирная линия (e6), красный псевдоцвет (e7)). Область в рамке: большее увеличение в (e7). (e8, 9) ВСФ (зеленый) колбочки (обозначен ARR3) в ГФ-ОСЧ. e ТЭМ и КСЭМ: каждый N=1, n = 3 ОСЧ/N. Митохондрии (М). Наружный (НЯС)/внутренний (ВЯС) ядерный слой
Рис. 3. Обработка TNF и HBEGF вызывает экструзию клеток фоторецепторов и дефекты внутреннего сегмента фоторецепторов (ВСФ). (а) Прижизненная визуализация ОСЧ. (b) Дифференциальный интерференционный контраст. (c) Конфокальная микроскопия с вращающимся диском. (b, c) НТ-ОСЧ и контроли (КОНТРОЛЬ) живут в культуре. Мечение ядер клеток SiR-ДНК живым красителем (остро применяется для визуализации). (b) Анфас изображение: эктопические ядра появились через 5 дней в НТ-ОСЧ на их поверхности, но не в контроле (оптическая плоскость расположена на уровне ВСФ). Независимые эксперименты: n = 10 ОСЧ (дополнительные данные 3). (с) Серия изображений поперечного сечения из дополнительного фильма 3: ядра клеток выходят за пределы апикальной границы органоида на его поверхность (желтая линия). Ядра клеток наружной сетчатки кажутся круглыми в контроле и до экструзии, а во время экструзии временно приобретают форму песочных часов. Независимые эксперименты с n = 8 ОСЧ (дополнительные данные 3). (d) НТ-ОСЧ по сравнению с КОНТРОЛЕМ, проанализированные с помощью сканирующей (СЭМ) электронной микроскопии (ЭМ) (1-2, 1’-2’), трансмиссионной (TЭМ) ОСЧ, залитых эпоксидной смолой (3, 5, 3’, 5 ‘-6’) и корреляционная световая электронная микроскопия (КЛЭМ) ультратонких криосрезов (4, 4’): окрашивание RCVRN (фоторецепторы, P), SLC1A3 (глия Мюллера, MG и DAPI (экструдированные (*) ядра клеток), визуализируется с помощью иммунофлуоресценции и золотых частиц (черные точки, золото 10 нм). N = 1 независимый эксперимент (N) с n=3 (TЭМ) и n = 5 (СЭМ) проанализированных ОСЧ (n). (e 1–5) Серия изображений TЭМ: фоторецепторы (P, зеленый псевдоцвет) во время или после экструзии (10-дневная НТ). Клеточные соединения (НПМ): отмечены красным. Ядро фоторецептора: звездочка. Двойная звездочка: мертвое ядро (e5). (е 6–9) КСЭМ НТ-ОСЧ (e6, e7: 10-дневная НТ; e8, e9: 20-дневная НТ), иммуномеченая для RCVRN (e6, 7) или ARR3 (e8, 9), и DAPI подтверждает, что фоторецепторы выдавливаются. (e6) Экструдированные клетки (звездочки) и (e7) фоторецептор в процессе продавливания через НПМ, обозначенный ядром в форме песочных часов и положением клеточных соединений (белая пунктирная линия (e6), красный псевдоцвет (e7)). Область в рамке: большее увеличение в (e7). (e8, 9) ВСФ (зеленый) колбочки (обозначен ARR3) в ГФ-ОСЧ. e ТЭМ и КСЭМ: каждый N=1, n = 3 ОСЧ/N. Митохондрии (М). Наружный (НЯС)/внутренний (ВЯС) ядерный слой
ой оболочки, развиваются в сочетании с патологиями мюллеровой глии (МГ), особенно рубцеванием, а также ремоделированием сетчатки, утолщением и дисламинацией. Наоборот, при других патологиях ФР толщина сетчатки просто уменьшается, а рубцы и ремоделирование преимущественно возникают на терминальных стадиях. В связи с этим разработка эффективной терапии по-прежнему остается сложной задачей, ведь именно воздействие на патологические процессы является эффективным способом лечения для широкого круга пациентов.

    Органоиды сетчатки человека (ОСЧ), полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (иПСКч), представляют собой уменьшенную модельную систему (рис. 1). ОСЧ воспроизводят некоторые ключевые аспекты развития и структуры сетчатки, но ее физиологические и синаптические функции несколько ограничены. Для развития у пациентов нейродегенераций могут уйти десятилетия, и до сих пор не ясно, как воспроизвести и ускорить патогенез на человеческих моделях. Нарушения развития и некоторые другие изменения при нейродегенерациях уже были смоделированы, однако остается неясным, в какой степени динамика (от начала до завершения) и сложность патогенеза могут быть воспроизведены в постмитотических органоидах.

    Для инициации нейродегенеративных изменений использовались фактор некроза опухоли (TNF) и гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HBEGF). TNF является провоспалительным фактором, регулирующим различные типы гибели клеток, и может быть вовлечен в дегенерацию ФР, а HBEGF вместе TNF регулируют глиальные патологические процессы, воспаление и регенерац
Рис. 4. Кинетика TNF/HBEGF-индуцированного патогенеза: одновременные и временно прогрессирующие патологии фоторецепторов и глии. (a) Экспериментальный план: НТ наносили ежедневно, а ОСЧ анализировали в указанные моменты времени. (b) Репрезентативные изображения ОСЧ, обработанных НТ, в светлом поле в культуре. (c) Репрезентативные изображения и (d) количественный анализ развития фоторецепторной и глиальной патологии: потеря клеток колбочек (ARR3) и палочек (NRL) фоторецепторов (RCVRN) и эктопия клеток, а также потеря ВСФ; глиоз (GFAP), пролиферацию клеток (KI67, PHH3) MГ (SOX9) и общее число клеток (DAPI). Графики показывают среднее значение ± стандартное отклонение, а кружки представляют отдельные ОСЧ (n), полученные из N = 1 независимого эксперимента (N) с n ≥ 5 на переменную. (b, c) N = 1 независимый эксперимент (N) с n ≥ 5 ОСЧ на момент времени. (e) Сводка количественных данных, изображенных в (d) и на дополнительном рисунке 12. Обобщенные данные представлены как среднее кратное изменение (шкала log2) по сравнению с контрольными (0 дней НТ) ОСЧ. Цветные линии под осью x отображают статистический анализ с использованием однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Тьюки (на основе отдельных ОСЧ (n)) в указанные моменты времени по сравнению с контролем (день 0; статистика по n)
Рис. 4. Кинетика TNF/HBEGF-индуцированного патогенеза: одновременные и временно прогрессирующие патологии фоторецепторов и глии. (a) Экспериментальный план: НТ наносили ежедневно, а ОСЧ анализировали в указанные моменты времени. (b) Репрезентативные изображения ОСЧ, обработанных НТ, в светлом поле в культуре. (c) Репрезентативные изображения и (d) количественный анализ развития фоторецепторной и глиальной патологии: потеря клеток колбочек (ARR3) и палочек (NRL) фоторецепторов (RCVRN) и эктопия клеток, а также потеря ВСФ; глиоз (GFAP), пролиферацию клеток (KI67, PHH3) MГ (SOX9) и общее число клеток (DAPI). Графики показывают среднее значение ± стандартное отклонение, а кружки представляют отдельные ОСЧ (n), полученные из N = 1 независимого эксперимента (N) с n ≥ 5 на переменную. (b, c) N = 1 независимый эксперимент (N) с n ≥ 5 ОСЧ на момент времени. (e) Сводка количественных данных, изображенных в (d) и на дополнительном рисунке 12. Обобщенные данные представлены как среднее кратное изменение (шкала log2) по сравнению с контрольными (0 дней НТ) ОСЧ. Цветные линии под осью x отображают статистический анализ с использованием однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Тьюки (на основе отдельных ОСЧ (n)) в указанные моменты времени по сравнению с контролем (день 0; статистика по n)
ию (рис. 2).

    Кроме того, среди многих кандидатов именно TNF и HBEGF являются предполагаемыми генами риска и факторами прогрессирования для ВМД. В этой работе авторы показывают, что комбинированного применения HBEGF и TNF (далее – НТ) в модельной системе человека достаточно, чтобы вызвать сложную патологию, при которой дегенерация ФР и патология МГ развиваются одновременно как один динамический фенотип, прогрессируя от начальной до конечной стадии. При этом модель очень эффективна: индуцибельна, дозозависима и воспроизводима.

    Важно, что ОСЧ однородно и надежно воспроизводит некоторые анатомические параметры фовеально-парафовеальной субобластей макулы.

    В данной работе впервые выявляется и описывается патомеханизм дегенерации фоторецепторов путем экструзии клеток. Экструзия может быть причиной смещенных/эктопических ФР, описанных при старении, а также у пациентов с ВМД и другими патологиями, такими как наследственные дистрофии сетчатки, вызванные мутациями в генах CRB1 и RPGR.

    Испытания с фармакологическими препаратами в ОСЧ предполагают, что воспалительные TNF/HBEGF и биомеханический PIEZO1 факторы могут индуцировать и/или усугублять невропатологию у пациентов, представляя собой неиспользованные терапевтические мишени для предотвращения не только экструзии ФР, но и других сложных невропатологий. В целом, результаты поддерживают универсальную доклиническую модель патологии человека, которая будет способствовать развитию исследований ВМД и других патологий.

    Результаты

    Дегенерация фоторецепторов включает клеточные дефекты и клеточную экструзию Чтобы определить, дегенерируют ли ФР в результате регулируемой экструзии клеток, и подтвердить, что это не артефакт обработки ткани, авторы проводили комбинированную дифференциально-интерференционную контрастную и флуоресцентную микроскопию анфас живых ОСЧ один раз в день (рис. 3а).

    Это показало, что клеточные ядра (помеченные SiR-ДНК) появлялись в большом количестве на внешней поверхности ОСЧ после 5–10 дней обработки ТН, но не в контроле (рис. 3b, n = 3 на переменную). Записи конфокальной микроскопии в течение среднего периода времени 12 часов на 5–8-й день лечения ТН выявили динамический процесс экструзии клеток: ядра клеток часто перемещались апикально мимо областей НПМ и ВСФ и, таким образом, выходили из сетчатки на поверхность (n = 5 ОСЧ). Иногда клеточные ядра, проходящие через НПМ, временно принимали форму песочных часов, что свидетельствует о том, что клетки могут протискиваться через НПМ, чтобы покинуть сетчатку (рис. 3c на 15–60 мин).

    Иммуногистология (рис. 2h, i) и сканирующая (СЭМ, рис. 3d1-2, d1’–2’), трансмиссионная (ТЭМ, рис. 3 d3, 3’, 5, 5’, 6’, e 1–5) и корреляционно-световая (КСЭМ, рис. 3d 4–5, d 4’, e 6–9) электронная микроскопия дали дополнительную информацию: в контроле ФР были расположены с их сомой и ядром в наружном ядерном слое ниже НПМ, а их ВСФ и НСФ выше (рис. 2h и 3 d1-5 и дополнительные рис. 2i, j и 5d, e), сравнимые с сетчаткой in vivo. В ТН-ОСЧ многочисленные сомы и ядра ФР были патологически эктопическими по отношению к НПМ, а количество ВСФ было уменьшено (рис. 2h, i и 3 d1’–4’), в то время как оставшиеся ВСФ показали нарушенные структуру и митохондрии (рис. 3d 5’–6’).

    Вместе живые и ультраструктурные изображения показывают морфологические изменения, поддерживающие несколько стадий экструзии ФР (рис. 3 d3’, 4’; e1–9) с расслаиванием их ядер и прохождением через НПМ, на что указывают ядра ФР в форме песочных часов (подтверждено с помо
Рис. 5. Фармакологическое ингибирование MEK или PIEZO1 ослабляет патологии фоторецепторов и глии в модели НТ-ОСЧ. (а) Схема эксперимента: начиная с 200 дня, ОСЧ культивировали в течение 10 дней с обработкой НТ или без нее. Селективный ингибитор (MEKi; U0126) киназ MAP-киназ (MEK1 и MEK2), который, как известно, ингибирует активацию MAPK, или GsMTx4, ингибитор PIEZO1 и других механочувствительных ионных каналов, добавляли к ОСЧ за 12 ч до применения НТ и в течение всего периода лечения НТ. (b) Репрезентативные изображения ROI, полученные из серийных срезов ОСЧ, окрашенных иммунохроматографией, и количественный анализ для определения влияния фармакологических ингибиторов на фенотип НТ-ОСЧ, включая состав клеток сетчатки, патологические изменения ВСФ (PIS), гибель клеток (TUNEL ), глиальная пролиферация, глиоз (GFAP) и дисламинация сетчатки. (c) Схематическая сводка эффектов ингибитора на фенотип, индуцированный HT; стрелки указывают на снижение тяжести фенотипа. (d) Графическое изображение статистического анализа количественных данных, показанных на (b). Темно-серые квадраты изображают значительные изменения (P <0,01, однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Тьюки) по сравнению с ОСЧ, получавшими НТ. (c) Графики: каждый кружок представляет 1 отдельный ОСЧ (n), полученный из N = 3 независимых экспериментов (n ≥ 5/N). (с) Графики (среднее значение ± стандартное отклонение) и (d) статистика по n
Рис. 5. Фармакологическое ингибирование MEK или PIEZO1 ослабляет патологии фоторецепторов и глии в модели НТ-ОСЧ. (а) Схема эксперимента: начиная с 200 дня, ОСЧ культивировали в течение 10 дней с обработкой НТ или без нее. Селективный ингибитор (MEKi; U0126) киназ MAP-киназ (MEK1 и MEK2), который, как известно, ингибирует активацию MAPK, или GsMTx4, ингибитор PIEZO1 и других механочувствительных ионных каналов, добавляли к ОСЧ за 12 ч до применения НТ и в течение всего периода лечения НТ. (b) Репрезентативные изображения ROI, полученные из серийных срезов ОСЧ, окрашенных иммунохроматографией, и количественный анализ для определения влияния фармакологических ингибиторов на фенотип НТ-ОСЧ, включая состав клеток сетчатки, патологические изменения ВСФ (PIS), гибель клеток (TUNEL ), глиальная пролиферация, глиоз (GFAP) и дисламинация сетчатки. (c) Схематическая сводка эффектов ингибитора на фенотип, индуцированный HT; стрелки указывают на снижение тяжести фенотипа. (d) Графическое изображение статистического анализа количественных данных, показанных на (b). Темно-серые квадраты изображают значительные изменения (P <0,01, однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Тьюки) по сравнению с ОСЧ, получавшими НТ. (c) Графики: каждый кружок представляет 1 отдельный ОСЧ (n), полученный из N = 3 независимых экспериментов (n ≥ 5/N). (с) Графики (среднее значение ± стандартное отклонение) и (d) статистика по n
щью RCVRN по CLEM; рис. 3e6, e7). Ядра и сома экструдированных ФР локализованы апикально от НПМ, а некоторые прикреплены к поверхности ОСЧ; большинство казались фенотипически здоровыми (как и контрольные), но некоторые имели измененную морфологию хроматина и маргинацию, указывающие на клеточный стресс или гибель (рис. 3e5). Анализ TUNEL подтвердил это: около 1,5% экструдированных колбочек и палочек действительно умирали, тогда как большинство клеток внутри сетчатки для различных анализов гибели клеток были отрицательными (рис. 2f, g). Однако повреждение и гибель клеток все же могли быть вызваны in situ и завершены после экструзии.

    Синхронное развитие патологий фоторецепторов и глии

    Чтобы определить, развиваются ли НТ-индуцированные патологии ФР и МГ совместно, как это часто наблюдается при сложных патологиях, была изучена кинетика патогенеза. Описанные выше маркеры количественно анализировались на 0, 2, 4, 6, 8, 10, 20 и 40 дни с момента обработки НТ (рис. 4). Через 4 дня количество колбочек стало значительно уменьшаться, и начался пролиферативный глиоз. В то время как гибель клеток всегда оставалась редкой, потеря ВСФ и экструзия ФР, вместе с потерей ФР и расслоением клеток временно увеличивались с 4 дня. ФР и MГ постепенно перераспределялись радиально, а количество MГ временно увеличивалось (рис. 4d). К 40-му дню ФР осталось совсем немного. Интересно, что НТ индуцировали патологический эффект уже при 2,5 нг/мл, а применение возрастающих концентраций до 50 нг/мл показало, что степень патологических изменений была дозозависимой. НТ индуцировали одновременное начало и пространственно-временное, синхронное, прогрессирующее и стимул-зависимое развитие патологий ФР и MГ как одного сложного фенотипа (рис. 4e).

    Выявление потенциальных механизмов и ассоциации заболеваний

    Чтобы получить представление о возможных патологических механизмах, было выполнено секвенирование РНК контрольных и обработанных НТ ОСЧ в разном возрасте органоидов: 150, 200 и 250 дней.

    Чтобы определить изменения в основных типах клеток и выбранных патологических процессах, предварительно были сформированы списки представляющих интерес генов для ФР, МГ и регуляторов экструзии клеток, зарегистрированных ранее для других органов. В результате было обнаружено несколько новых генов, которые могут обеспечить доступ к еще не до конца изученным механизмам, таким как экструзия и ремоделирование клеток.

    Интересной находкой оказалась причастность механосенсора PIEZO1, регулирующего экструзию клеток в других органах и концентрация которого увеличивается в реактивной глие. PIEZO1 экспрессируется на низких уровнях в колбочках людей и ОСЧ. Также было выявлено, что с гибелью ФР, глиальной пролиферацией и, возможно, НДС/ ВМД была связана активация MAPK1.

    Фармакологические препараты для потенциальных регуляторов экструзии клеток предотвращают комплексную патологию

    Чтобы глубже понять и верифицировать предполагаемые патомеханизмы, изучению были подвергнуты выявленные с помощью транскриптомики PIEZO1 и MAPK.

    Для этого использовались ингибитор PIEZO1 «GsMTx4» (механотоксин 4 grammostola spatulata) представляет собой пептид, первоначально идентифицированный в глии, и химический двойной ингибитор MAPK «MEK1/MEK2». Также, учитыва
Рис. 6. Активатора PIEZO1 YODA1 достаточно, чтобы вызвать экструзию фоторецепторов, а отдельного применения TNF или HBEGF – нет. (a) Экспериментальный план: начиная с 200 дня на ОСЧ воздействовали активатором PIEZO1-канала YODA1 (Y) отдельно или в комбинации либо с HBEGF (H), либо с TNF (T). Кроме того, ОСЧ также лечили HBEGF или TNF отдельно или в комбинации (НТ). (-)-Блеббистатин (BLEB, B), ингибитор миозина II, применяли к некоторым ОСЧ, получавшим НТ, начиная за 12 ч до применения НТ, а затем в течение всего периода лечения НТ. ОСЧ были проанализированы на 210 день. (b) Репрезентативные изображения ROI, записанные с серийных срезов ОСЧ, окрашенные иммунохроматографией, и количественно проанализированные для определения эффекта лечения, включая состав клеток сетчатки, патологические изменения внутренних сегментов фоторецепторов, гибель клеток (TUNEL), глиальная пролиферация, глиоз (GFAP) и деламинация MГ. (c) Схематическое резюме эффектов лечения на ОСЧ: лечение не вызывало никакого (-), незначительный ((+)), или основной (+) фенотип, или снижение (стрелки) тяжести фенотипа по сравнению с НТ. (d) Графическое изображение статистического анализа количественных данных, показанных в (b). Темносерые квадраты изображают значительные изменения (P <0,01, однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Тьюки) по сравнению с контролем (CTRL) или ОСЧ, обработанными НТ, соответственно. (c) Графики: каждый кружок представляет 1 отдельный ОСЧ (n), полученный из N = 3 независимых экспериментов (n ≥ 5/N). (c) Графики (среднее значение ± стандартное отклонение) и (d) статистика по n. Виды лечения указаны (+). Шкала баров: b 50 мкм
Рис. 6. Активатора PIEZO1 YODA1 достаточно, чтобы вызвать экструзию фоторецепторов, а отдельного применения TNF или HBEGF – нет. (a) Экспериментальный план: начиная с 200 дня на ОСЧ воздействовали активатором PIEZO1-канала YODA1 (Y) отдельно или в комбинации либо с HBEGF (H), либо с TNF (T). Кроме того, ОСЧ также лечили HBEGF или TNF отдельно или в комбинации (НТ). (-)-Блеббистатин (BLEB, B), ингибитор миозина II, применяли к некоторым ОСЧ, получавшим НТ, начиная за 12 ч до применения НТ, а затем в течение всего периода лечения НТ. ОСЧ были проанализированы на 210 день. (b) Репрезентативные изображения ROI, записанные с серийных срезов ОСЧ, окрашенные иммунохроматографией, и количественно проанализированные для определения эффекта лечения, включая состав клеток сетчатки, патологические изменения внутренних сегментов фоторецепторов, гибель клеток (TUNEL), глиальная пролиферация, глиоз (GFAP) и деламинация MГ. (c) Схематическое резюме эффектов лечения на ОСЧ: лечение не вызывало никакого (-), незначительный ((+)), или основной (+) фенотип, или снижение (стрелки) тяжести фенотипа по сравнению с НТ. (d) Графическое изображение статистического анализа количественных данных, показанных в (b). Темносерые квадраты изображают значительные изменения (P <0,01, однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Тьюки) по сравнению с контролем (CTRL) или ОСЧ, обработанными НТ, соответственно. (c) Графики: каждый кружок представляет 1 отдельный ОСЧ (n), полученный из N = 3 независимых экспериментов (n ≥ 5/N). (c) Графики (среднее значение ± стандартное отклонение) и (d) статистика по n. Виды лечения указаны (+). Шкала баров: b 50 мкм
я конденсированные актиновые волокна в MГ, повышенную экспрессию генов, связанных с RHO-ROCKMYOSIN и функцию актомиозина в экструзии, было проверено, влияет ли широко используемый ингибитор немышечного миозина II, (-)-блеббистатин (BLEB) на патологии ФР и MГ.

    Фармакологические препараты применяли за 12 ч до и в течение 10 дней после воздействия НТ (рис. 5а).

    Каждый из обоих ингибиторов заметно уменьшал индуцированное НТ утолщение сетчатки, в результате чего гистологически и количественно ткани были больше похожи на контрольную ОСЧ, нежели на НТ-ОСЧ (рис. 5b–d). Были предотвращены не только потеря колбочек и палочек, но также и экструзия ФР и потеря внутреннего слоя фоторецепторов (рис. 5b–d). Оба ингибитора также снижали глиальную реактивность (GFAP/DAPI, P<0,0001), пролиферацию (SOX9/DAPI, P<0,0001) и деламинацию клеток. Функция PIEZO1 была изучена и с обратной стороны, для этого исследователи применили его химический активатор YODA1 без и в сочетании с TNF и HBEGF.

    Поразительно, что однократного использования YODA1 было достаточно, чтобы вызвать серьезную потерю колбочек (42% ARR3, P<0,0001) и палочек (49% NRL,Г P<0,0001) посредством экструзии клеток (рис. 6). YODA1 также вызывал глиоз, но количество MГ увеличивалось только в сочетании с TNF и HBEGF. BLEB частично предотвратил потерю колбочек/палочек, а также эктопию ФР, потерю ВСФ и пролиферацию MГ (рис. 6). Однако BLEB не уменьшал ни глиоз, ни деламинацию, что свидетельствует о функции актина ниже PIEZO1/MAPK. Как правило, анализ указывал на почти полное отсутствие гибели клеток in situ (рис. 5b). Примечательно, что применения только ГСЭФР или ФНО было недостаточно, чтобы вызвать сложную патологию в течение изучаемого периода времени, что подтверждает более ранние исследования и указывает на синергетические и аддитивные функции НТ, ранее неизвестные для нервной системы.

    Обсуждение

    В данной работе авторы показывают, что комбинированное (не по отдельности) воздействие TNF или HBEGF способно индуцировать ряд патологических процессов, которые динамично и прогрессивно развиваются как один сложный фенотип, характерный для нейродегенеративных заболеваний сетчатки (рис. 7а). Эта экспериментальная модель (органоид) позволила выявить механизм дегенерации ФР за счет экструзии (вытеснения) клеток, опосредованной воспалительными и биомеханическими регуляторами (рис. 7b), при этом они же являются потенциальными терапевтическими мишенями для предотвращения не только вытеснения ФР, но и управления комплексными патологиями (рис. 7 c, d).

    Одной из перспектив технологии органоидов является воспроизведение сложных невропатологий, а модель НТ-ОСЧ продвигает наше общее понимание патогенности и взаимосвязи нескольких одновременно развивающихся патологий и обеспечивает отправную точку для еще более сложных моделей. ОСЧ – это редукционистская система, выгодная для сосредоточения внимания на основных типах клеток. До сих пор
Рис. 7. Резюме: фенотип модели НТ-ОСЧ, механизм действия и потенциальная связь с патологиями сетчатки. (а) Схема модели патологии, индуцированной НТ в органоидах сетчатки: несколько различных гистопатологических процессов постепенно развиваются в пространственно-временной комбинации и поддаются количественному определению. Дегенерация фоторецепторов (ФР) колбочек и палочек посредством смещения апикальных клеток (эктопия) из сетчатки с последующей гибелью клеток в сочетании с несколькими патологиями глии Мюллера представляет собой один сложный фенотип. Данные об ультраструктурных, молекулярных и функциональных фармакологических ингибиторах указывают на механизм. (b) Применение НТ или активация PIEZO1 вызывает дегенерацию ФР посредством экструзии клеток с обширными глиальными патологиями или без них, соответственно. Ингибирование передачи сигналов MAPK (UO126), PIEZO1 (GsMTx4) или актин-миозина (BLEB, Blebbistatin) эффективно предотвращает не только экструзию ФР, но и формирование сложного фенотипа. (c) Суммарная схема, изображающая сетчатку здорового человека и отдельные патологические процессы, потенциально имеющие отношение к ВМД и другим патологиям, и (d, e) потенциальные источники и функции TNF, HBEGF и биомеханического стресса при патологиях сетчатки (обозначены красным цветом и пронумерованы) в качестве основы для обсуждения и предположений о потенциальной значимости патологических процессов, воспроизводимых в модели НТ-ОСЧ пациентов. Некоторые ключевые гипотезы: дегенерация ФР путем экструзии может лежать в основе смещения ФР (белая стрелка), возможно, связанного со старением, прогрессирующей ВМД и некоторыми другими патологиями. Потеря внутреннего слоя фоторецепторов является отличительной чертой окончательной и необратимой потери зрения, которая может быть причиной или следствием экструзии ФР и рубцевания. Формирование глиального рубца может вызвать или способствовать экструзии ФР, а также сложным или терминальным патологиям сетчатки. Патологии могут индуцировать НТ из различных источников (пронумерованы), включая клетки сетчатки, микроглию или системно, а также изменения структуры сетчатки или биофизических свойств клеток или тканей, например, из-за внеклеточного патологического материала или изменений хориоидеи/ПЭС. Легенда к изображению: (1) глия Мюллера; (2) ФР; (3) внутренние сегменты ФР; (4) микроглия; (5) ретинальный пигментный эпителий; (6) экструзия РПЭ; (7) весь организм; (8) субретинальные друзеноидные отложения, которые могут быть результатом выдавливания фоторецепторов (белые стрелки); (9) друзы (внеклеточный патологический материал ниже ПЭС)
Рис. 7. Резюме: фенотип модели НТ-ОСЧ, механизм действия и потенциальная связь с патологиями сетчатки. (а) Схема модели патологии, индуцированной НТ в органоидах сетчатки: несколько различных гистопатологических процессов постепенно развиваются в пространственно-временной комбинации и поддаются количественному определению. Дегенерация фоторецепторов (ФР) колбочек и палочек посредством смещения апикальных клеток (эктопия) из сетчатки с последующей гибелью клеток в сочетании с несколькими патологиями глии Мюллера представляет собой один сложный фенотип. Данные об ультраструктурных, молекулярных и функциональных фармакологических ингибиторах указывают на механизм. (b) Применение НТ или активация PIEZO1 вызывает дегенерацию ФР посредством экструзии клеток с обширными глиальными патологиями или без них, соответственно. Ингибирование передачи сигналов MAPK (UO126), PIEZO1 (GsMTx4) или актин-миозина (BLEB, Blebbistatin) эффективно предотвращает не только экструзию ФР, но и формирование сложного фенотипа. (c) Суммарная схема, изображающая сетчатку здорового человека и отдельные патологические процессы, потенциально имеющие отношение к ВМД и другим патологиям, и (d, e) потенциальные источники и функции TNF, HBEGF и биомеханического стресса при патологиях сетчатки (обозначены красным цветом и пронумерованы) в качестве основы для обсуждения и предположений о потенциальной значимости патологических процессов, воспроизводимых в модели НТ-ОСЧ пациентов. Некоторые ключевые гипотезы: дегенерация ФР путем экструзии может лежать в основе смещения ФР (белая стрелка), возможно, связанного со старением, прогрессирующей ВМД и некоторыми другими патологиями. Потеря внутреннего слоя фоторецепторов является отличительной чертой окончательной и необратимой потери зрения, которая может быть причиной или следствием экструзии ФР и рубцевания. Формирование глиального рубца может вызвать или способствовать экструзии ФР, а также сложным или терминальным патологиям сетчатки. Патологии могут индуцировать НТ из различных источников (пронумерованы), включая клетки сетчатки, микроглию или системно, а также изменения структуры сетчатки или биофизических свойств клеток или тканей, например, из-за внеклеточного патологического материала или изменений хориоидеи/ПЭС. Легенда к изображению: (1) глия Мюллера; (2) ФР; (3) внутренние сегменты ФР; (4) микроглия; (5) ретинальный пигментный эпителий; (6) экструзия РПЭ; (7) весь организм; (8) субретинальные друзеноидные отложения, которые могут быть результатом выдавливания фоторецепторов (белые стрелки); (9) друзы (внеклеточный патологический материал ниже ПЭС)
не ясно, является ли НТ таким же патогенным in vivo, или же для этого требуется клеточный стресс, потенциально присутствующий в ОСЧ, но не у здоровых людей, и зависит ли он от состава клеток. Авторы использовали систему ОСЧ с большим количеством колбочек, надежно воспроизводящую состав клеток ФР и МГ, а также несколько параметров, обнаруженных на границе фовеа-парафовеа. Поскольку дегенерация ФР в фовеа-парафовеа заметна при промежуточной/продвинутой ВМД и других патологиях, будет интересно определить, смогут ли ОСЧ также воспроизводить другие особенности данной области.

    Сравнение развития макулы, субрегионов сетчатки и проверка модели НТ-ОСЧ на первичных сетчатках человека и животных продвинет наше понимание.

    Volkner M, Wagner F, Steinheuer LM, Carido M, Kurth T, et al. HBEGF-TNF induce a complex outer retinal pathology with photoreceptor cell extrusion in human organoids. Nat Commun. 2022;13(1): 6183. doi: 10.1038/s41467-022-33848-y

    Материал в рубрику «Фундаментальные исследования в офтальмологии» подготовила врач-офтальмолог, врач-генетик, к.м.н. Шурыгина М.Ф

    

OAI-PMH ID: oai:eyepress.ru:article57063
Просмотров: 620


Офтальмохирургия

Офтальмохирургия

Новое в офтальмологии

Новое в офтальмологии

Мир офтальмологии

Мир офтальмологии

Российская офтальмология онлайн

Российская офтальмология онлайн

Российская детская офтальмология

Российская детская офтальмология

Современные технологии в офтальмологии

Современные технологии в офтальмологии

Точка зрения. Восток - Запад

Точка зрения. Восток - Запад

Новости глаукомы

Новости глаукомы

Отражение

Отражение

Клинические случаи в офтальмологии

Клинические случаи в офтальмологии
Bausch + Lomb
Reper
NorthStar
ЭТП
Rayner
Senju
Фармстандарт
Гельтек
santen
Акрихин
Ziemer
Tradomed
Екатеринбургский центр Микрохирургия глаза
МТ Техника
Nanoptika
R-optics
Фокус
sentiss
nidek
aseptica