Рис. 1. Гистологическая картина биоптата конъюнктивы человека толщиной 70 мкм, полученного фемтолазером (1-я группа). А. Сохраненная архитектоника клеток в эпителии конъюнктивы. Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Б. Фуксинофилия коллагеновых волокон базальной пластинки эпителия (отмечено стрелками). Микрофотография. Окраска по Ван Гизону Fig. 1. Histological picture of a human conjunctiva biopsy 70 µm thick obtained with a femtolaser (Group 1). A. Preserved cell architectonics in the conjunctival epithelium. Micrograph. Stained with hematoxylin and eosin. Б. Fuchsinophilia of collagen fibers of the basal lamina of the epithelium (marked by arrows). Micrograph. Coloring according to Van Gieson
Рис. 2. Гистологическая картина биоптата конъюнктивы человека толщиной 80 мкм, полученного фемтолазером (2-я группа). А. Признаки деструкции поверхностных слоев эпителия. Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином. Б. Кавитационные пузырьки (отмечено стрелками) в базальной соединительнотканной пластинке эпителия конъюнктивы. Микрофотография. Окраска по Ван Гизону Fig. 2. Histological picture of a human conjunctiva biopsy 80 µm thick, obtained with a femtolaser (group 2). A. Signs of destruction of the surface layers of the epithelium. Micrograph. Stained with hematoxylin and eosin. Б. Cavitation vesicles (marked by arrows) in the basal connective tissue plate of the conjunctival epithelium. Micrograph. Coloring according to Van Gieson
Лечение птеригиума осуществляется исключительно хирургическим способом. Имеются разнообразные методики оперативных вмешательств по поводу данного заболевания, в том числе с использованием различных видов трансплантатов с их шовной фиксацией. Для закрытия раневой поверхности на месте удаленного птеригиума часто используют законсервированные алломатериалы из капсулы почки или амниотической мембраны. Следует отметить, что наиболее качественным способом пересадки биотканей является аутотрансплантация, поскольку она рассчитана на истинное приживление трансплантата за счет отсутствия реакции иммунологической и тканевой несовместимости [2]. В настоящее время одним из хирургических новшеств в лечении птеригиума является использование аутолоскута из бульбарной конъюнктивы, полученного с помощью фемтосекундного лазера [3]. Однако при этом сохраняется необходимость оценки морфологического состояния и размеров аутоконъюнктивального трансплантата, в частности его толщины, что важно для выбора оптимальной хирургической тактики, быстрого приживления трансплантата и минимального травмирования донорского участка.
Цель
Дать морфологическую оценку биоптатов конъюнктивы человека, полученных мануально и с помощью фемтосекундного лазера.
Материал и методы
Морфологическое изучение было проведено в 4 группах пациентов с птеригиумом, которым была произведена аутопластика лоскутом бульбарной конъюнктивы. Были получены биоптаты конъюнктивы округлой формы (5×5 мм) : в 1, 2 и 3-й группах лоскуты толщиной 70, 80 и 100 мкм соответственно вырезали с помощью фемтосекундного лазера Ziemer Ophthalmology Femto LDV Z8 (Швейцария), в 4-й группе лоскут минимально возможной толщины выкраивали мануально.
Для гистологического исследования биоптаты фиксировали в 10% нейтральном формалине с буфером.
Проводили обезвоживание гистоматериала в спиртах возрастающей концентрации, проводку и заливку в парафин выполняли по общепринятым методикам. Гистологические срезы толщиной 1–4 мкм готовили на ротационном микротоме RM 2145 (Leica Microsystems, Германия), окрашивали гематоксилином и эозином и по методу Ван Гизона. Световая микроскопия гистологических срезов и их микрофотосъемка проводились с помощью микроскопа LEICA DM 2500 (Leica Microsystems, Германия) с аппаратно-программным комплексом LAS V.4.1 и цифровой фотокамеры LEICA DFC 450 (Leica Microsystems, Германия).
Результаты
Результаты проведенных морфологических исследований биоптатов бульбарной конъюнктивы человека, полученных с помощью фемтосекундного лазера, показали, что лоскуты толщиной 70 мкм (1-я группа) сохраняли целостность эпителиального покрова во всех исследованных гистопрепаратах. При этом наблюдали непрерывность базального слоя эпителия и состоятельность клеточной архитектоники в целом (рис. 1А).
Обращает на себя внимание уплотнение базальной подэпителиальной пластинки, о чем свидетельствует выраженная фуксинофилия коллагеновых волокон (рис. 1Б). В соединительнотканной строме, так же как и в эпителиальном слое конъюнктивы, признаки деструкции, характерные для коагуляционных изменений, не выявлялись, каких-либо патоморфологических изменений не обнаружено.
В фемтолоскутах конъюнктивы толщиной 80 мкм (2-я группа) определяли слабовыраженные деструктивные изменения в эпителиальном слое, на некоторых участках которого визуализировали эпителиоциты, включающие своеобразные пустоты в цитоплазме (рис. 2А).
Поверхностные слои эпителия были уплотнены, что является характерным признаком коагуляционных изменений. На рисунке 2Б показаны единичные кавитационные пузырьки, характерные для лазерного воздействия, которые в ряде гистопрепаратов визуализировали на участках утолщенной базальной пластинки.
Рис. 3. Гистологическая картина биоптата конъюнктивы человека толщиной 100 мкм, полученного фемтолазером (3-я группа). А. Локальные очаги коагуляции эпителия (показано стрелкой), кавитационные пузырьки в конъюнктиве после воздействия фемтолазера. Микрофотография. Окраска по Ван Гизону. Б. Деструктивные изменения в слоях эпителия конъюнктивы. Микрофотография. Окраска по Ван Гизону Fig. 3. Histological picture of a human conjunctival biopsy 100 µm thick, obtained with a femtolaser (3rd group). A. Local epithelial coagulation foci (shown by an arrow), cavitation vesicles in the conjunctiva after exposure to a femtolaser. Micrograph. Coloring according to Van Gieson. Б. Destructive changes in the layers of the epithelium of the conjunctiva. Micrograph. Coloring according to Van Gieson
Рис. 4. Гистологическая картина биоптата конъюнктивы человека, полученного мануально (4-я группа). А. Нарушение непрерывности эпителиального пласта с отрывом фрагмента. Микрофотография. Окраска по Ван Гизону. Б. Стрелками отмечены расширенные микрососуды в соединительнотканной строме. Микрофотография. Окраска гематоксилином и эозином Fig. 4. Histological picture of a human conjunctiva biopsy taken manually (Group 4). A. Disruption of the continuity of the epithelial layer with detachment of a fragment. Micrograph. Coloring according to Van Gieson. Б. Arrows indicate dilated microvessels in the connective tissue stroma. Micrograph. Stained with hematoxylin and eosin
При использовании мануальной методики получения трансплантата конъюнктивы наблюдали следующие изменения: в эпителиальном покрове регистрировали нарушение непрерывности клеточных слоев, вплоть до отрыва отдельных фрагментов эпителия (рис. 4А).
В подлежащей соединительнотканной строме отмечали некоторую фрагментацию и расслоение волокнистых пучков с явлениями отечности. Обнаруживались несколько расширенные микрососуды, что также служит признаком реактивного отека (рис. 4Б). Тинкториальные свойства коллагеновых волокон, клеток эпителия и стромы сохранены.
Обсуждение
Использование фемтосекундного лазера, несмотря на достаточно щадящий режим локального энергетического воздействия по отношению к биотканям, способно вызывать некоторые незначительные морфологические изменения в структуре биоптата конъюнктивы.
Имеются различные варианты энергетического воздействия на орган зрения. Так, было показано влияние энергии ультрафиолета 5,4 Дж/см2 длиной волны 370 нм, оказываемое ультрафиолетовым кросслинкингом роговичного коллагена, на строение роговицы. При этом кросслинкинг-индуцированные клинические признаки носили транзиторный характер и проходили в среднем в течение 7 дней, тогда как морфологические и ультраструктурные изменения (снижение популяции кератоцитов, очаги разволокнения коллагена, отек стромы роговицы) наблюдались достаточно долго – более чем 3 месяца [4].
Использование бульбарной аутоконъюнктивы для пластической хирургии птеригиума имеет ряд преимуществ в сравнении с использованием других видов трансплантационных материалов. Аутотрансплантация – это идеальный вариант пересадки ткани, при этом проходит минимальное время от момента изъятия до ее применения, не требуется дополнительной обработки аутолоскута. Получение донорской ткани конъюнктивы с захватом зоны лимба и дальнейшая ее пересадка на роговицу «лимб в лимб» могут значительно снижать срок приживления и последующего замещения трансплантата [3].
Использование фемтолазера позволяет получать достаточно тонкие лоскуты, которые могут фиксироваться бесшовно, в частности, фибриновым клеем [3]. Приживление аутоткани малой толщины происходит быстрее, в том числе за счет сохранения естественной аэрации зоны наложения трансплантата. При этом происходит быстрая эпителизация донорского участка, не требующая ушивания. Следует отметить, что в литературе представлены сведения о существенном снижении числа рецидивов после хирургического лечения птеригиума с использованием аутолоскута конъюнктивы, полученного с помощью фемтолазера [3, 5].
К недостаткам мануальной техники получения конъюнктивального трансплантата следует отнести вероятность повреждения теноновой оболочки, при этом очень часто конъюнктивальную рану донорского участка необходимо ушивать. Особенностью мануальной техники подготовки конъюнктивального трансплантата является формирование лоскута с недостаточно ровными краями, неравномерной и непрогнозируемой толщиной. В структуре таких биоптатов отмечаются нарушение непрерывности клеточных слоев, участки разрыва эпителия. При этом механическая травма, сопровождающая формирование лоскута, может быть причиной появления локальных признаков альтерации и отека в структуре трансплантата. Однако следует особо подчеркнуть, что использование различных способов (мануальная техника или с помощью фемтолазера) получения трансплантата конъюнктивы не исключает применения каждого из них в практической медицине. Выполненные нами морфологические исследования показали, что все изучаемые биоптаты конъюнктивы пригодны для хирургических манипуляций и могут применяться в зависимости от оснащения клиники фемтолазером или выбранной тактики оперативного вмешательства, обусловленной глубиной и площадью раневого участка после удаления птеригиума, а также характером фиксации (шовной или бесшовной) аутолоскута.
Заключение
Проведенные исследования биоптатов конъюнктивы человека позволили установить, что при формировании фемтолазером лоскута толщиной 80 и 100 мкм отмечаются морфологические изменения в виде деструкции клеток эпителия, появления очагов коагуляции в эпителиальном слое и кавитационных пузырьков в соединительнотканной строме. Установлено, что выраженность патологических изменений возрастает по мере увеличения глубины реза конъюнктивы, что может быть связано с использованием для этой цели более высокой мощности энергетического воздействия фемтосекундного лазера. Установлено, что наименьшие патогистологические изменения в биоптатах конъюнктивы глазного яблока наблюдаются при получении фемтолоскута толщиной 70 мкм.
Информация об авторах
Ренат Амирович Казакбаев – зав. 2-м микрохирургическим отделением Уфимского НИИ глазных болезней, L_c_u@mail.ru, https:/orcid/0000-0002-1064-6468
Валентина Константиновна Суркова – д.м.н., профессор, старший научный сотрудник отделения роговицы и хрусталика Уфимского НИИ глазных болезней, ufaeyenauka@mail.ru, https:/orcid/0000-0003-4964-263X
Азат Рашидович Халимов – д.б.н., зав. научно-инновационным отделением Уфимского НИИ глазных болезней, azrakhal@yandex.ru, https:/orcid/0000-0001-7470-73330
Сагит Асхатович Муслимов – д.м.н., зав. отделом морфологии, Всероссийский центр глазной и пластической хирургии, https:/orcid/0000-0002-9076-0251.
Information about the authors
Renat A. Kazakbaev – Head of 2nd surgical department, Ufa Eye Reserch Institute, L_c_u@mail.ru, https:/orcid/0000-0002-1064-6468
Valentina K. Surkova – PhD, professor. Senior Researcher, corneal and lens surgery department, Ufa Eye Reserch Institute, ufaeyenauka@mail.ru, https:/orcid /0000-0003-4964-263X
Azat R. Khalimov – Doctor of biological Sciences, Head of Scientific and innovation department, Ufa Eye Reserch Institute, azrakhal@yandex.ru, https:/orcid/0000-0001-7470-73330
Sagit A. Muslimov – PhD, Head of the Department of Morphology, All-Russian Center for Eye and Plastic Surgery, https:/orcid/0000-0002-9076-0251
Вклад авторов в работу:
А.Р. Халимов: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, написание, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
В.К. Суркова: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
Р.А. Казакбаев: хирургическое ведение, сбор, анализ и обработка материала, написание, редактирование.
С.А. Муслимов: биомикроскопическое исследование, окраска и описание микропрепаратов.
Authors’ contribution:
A.R. Khalimov: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of material, statistical processing of data, writing, editing, final approval of the version to be published.
V.K. Surkova: significant contribution to the concept and design of the work, final approval of the version to be published.
R.A. Kazakbaev: surgical management, collection, analysis and processing of material, writing, editing.
S.A. Muslimov: biomicroscopic examination, staining and description of micropreparations.
Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.
Конфликт интересов: Отсутствует.
Financial transparency: Authors have no financial interest in the submitted materials or methods.
Conflict of interest: None.
Поступила: 22.03.2022
Переработана: 05.03.2022
Принята к печати: 08.04.2022
Originally received: 22.03.2022
Final revision: 05.03.2022
Accepted: 22.03.2022
