Особенности содержания трансформирующих факторов роста – бета 1,2,3 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3) во внутриглазной жидкости при первичной открытоугольной глаукоме

    Актуальность

     Несмотря на большое количество научных публикаций, посвященных изучению патогенеза первичной открытоугольной глаукомы, до настоящего времени многие его аспекты, особенно на клеточно-молекулярном уровне, остаются дискутабельными и требуют углубленного исследования.

    В научной литературе присутствуют данные морфологических и ультраструктурных исследований, свидетельствующие о том, что уже на начальных этапах развития глаукоматозного процесса в тканях органа зрения происходят изменения, в дальнейшем проявляющиеся признаками деструкции, дезорганизации соединительной ткани, фибриноидным набуханием, фиброзом, склерозированием. В ряде исследований было показано, что в структуре стенки шлеммова канала выявляется большое содержание депозитов внеклеточного материала в подэндотелиальном слое, возрастание количества лизосом и набухание митохондрий в эндотелии, а также возрастание плотности межэндотелиальных контактов. Указанные изменения, по мнению авторов, свидетельствуют, что в механизмах развития первичной открытоугольной глаукомы значимую роль играет деструктивно-воспалительный процесс, в инициации которого важное значение отводится изменению содержания и баланса цитокинов – биологически активных медиаторов межклеточных взаимоотношений [1-9].

     В современной научной литературе представлены данные исследований о наличии дисбаланса различных классов цитокинов, факторов роста и других биологически активных субстанций при развитии первичной открытоугольной глаукомы и рассматривается их возможная роль в развитии процессов нейродегенерации, повреждения трабекулы и др., однако окончательных выводов и заключений в настоящее время не сделано [1, 6, 8, 10-17].

    В последние годы внимание многих исследователей направлено на изучение роли суперсемейства трансформирующих фактора роста β в патогенезе глаукоматозного процесса, что связано с широким спектром биологических эффектов, реализующихся при активации синтеза этой группы цитокинов, обладающих выраженной противовоспалительной активностью и способностью влиять на процессы пролиферации, клеточного роста, дифференцировки, адгезии, синтеза белков внеклеточного матрикса, регуляцию иммунного ответа, апоптоз и др. [18-20].

    Применительно к первичной открытоугольной глаукоме исследователи рассматривают изменение содержания представителей семейства TGF-β как негативный фактор, реализация которого приводит к активации синтеза белков внеклеточного матрикса и его ремоделированию в трабекулярной сети, что приводит к увеличению сопротивления оттоку внутриглазной жидкости и повышению внутриглазного давления. Однако во многих исследованиях мало обсуждается взаимосвязь повышения концентраций семейства TGF-β с факторами, играющими роль в патогенезе глаукомы (гипоксия, активация процессов свободно-радикального окисления, воспаление) и способными вызвать активацию синтеза этих факторов роста [1, 9, 21-25].

    В связи с продолжающейся научной дискуссией о значимости воспалительного процесса в механизмах развития первичной открытоугольной глаукомы и роли в них нарушений цитокиновой регуляции, включая изменения содержания трансформирующих факторов роста, а также их участии в процессах ремоделирования внеклеточного матрикса и избыточного рубцевания после антиглаукоматозных операций, представляется актуальным проведение дальнейших исследований в этой области.

    Цель

    Изучить содержание трансформирующих фактора роста – бета 1,2,3 (TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3) во внутриглазной жидкости пациентов с развитой стадией первичной открытоугольной глаукомы.

    Материал и методы

    Исследование проводилось в рамках выполнения государственного задания ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, тема НИР: «Изучение патогенеза открытоугольной глаукомы на основе оценки дисбаланса цитокинов и факторов роста».

    Для решения поставленной цели были обследованы 50 пациентов с верифицированным на основании офтальмологического обследования диагнозом развитой стадии первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ), которые составили основную группу.

    Диагноз выставлялся на основании стандартного офтальмологического обследования, включающего определение остроты зрения, бинокулярную офтальмоскопию, сферопериметрию, эхоофтальмографию, оптическую когерентную томографию, измерение внутриглазного давления.

    В качестве значений сравнения, определяемых в настоящем исследовании показателей внутриглазной жидкости, были использованы данные, полученные при хирургическом лечении 30 пациентов с диагнозом неосложненной катаракты, составивших контрольную группу.

    Критериями исключения из исследования являлось наличие острых и обострения хронических воспалительных заболеваний органа зрения, диабетической ретинопатии, неоваскулярной глаукомы, увеита различной этиологии и локализации, гемофтальма, аутоиммунных и опухолевых процессов любой локализации, а также острых и обострений хронических воспалительных заболеваний любой локализации.

    Также из исследования исключались пациенты, принимавшие для нормализации внутриглазного давления препараты, содержащие аналоги простагландинов, которые способны активировать местный воспалительный процесс.

    У всех пациентов на начальных этапах проведения оперативного лечения были забраны образцы внутриглазной жидкости (75-100 мкл), которые были заморожены и хранились при -70° С до проведения исследования.

    Перед проведением лабораторного анализа по определению цитокинов однократно замороженная внутриглазная жидкость размораживалась до комнатной температуры. Для удаления осадка проводили её центрифугирование при 4° C, 10000 об/мин, 10 минут.

    Концентрацию изоформ трансформирующего фактора роста бета определяли с использованием набора Bio-Plex Pro™ TGF-β 3-plex Assay методом проточной флюориметрии на двухлучевом лазерном анализаторе Bio-Plex 200, Bio-Rad, США. Во внутриглазной жидкости одномоментно определялись 3 изоформы (TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3).

    Для обработки данных применялось программное обеспечение (Bio-Plex manager Software version 4.1). Концентрация цитокинов выражалась в пг/мл. Полученные цифровые данные были подвергнуты статистическому анализу и представлены в виде таблицы и графиков. Анализ данных проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 10 производства Stat Soft Inc (США). Использование критерия Колмогорова-Смирнова и Лилиефорса для нормальности позволило установить отсутствие нормальности распределения в полученных выборках. В связи с этим в исследовании были использованы методы непараметрической статистики. Значимость различий вариационных рядов в несвязанных выборках оценивали с помощью критерия Манна-Уитни. Корреляция показателей вычислялась по методу Спирмена. Данные представлены в виде M±m, где: M – средняя, m – ошибка средней. Достоверным считали различие между сравниваемыми рядами с уровнем достоверной вероятности 95% (р< 0,05).

    Исследование было одобрено комитетом по биомедицинской этике и проведено в соответствии с принципами Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека», Федеральным законом Российской Федерации от 21 ноября 2011 г. № 323 ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации», а также требованиями Федерального закона от 27.07.2006 г. № 152-ФЗ (ред. от 21.07.2014 г.) «О персональных данных» (с изм. и доп., вступ. в силу с 01.09.2015 г.). У всех пациентов было получено информированное согласие на проведение операции, забор внутриглазной жидкости, а также использование данных исследования в научных целях.

    Результаты

     В результате проведенных исследований были получены данные, представленные в графиках.

    При определении содержания и статистической обработке полученных данных было показано, что концентрация TGF-β 1 во внутриглазной жидкости пациентов контрольной группы была статистически значимо более низкой, чем в исследуемой биологической жидкости у пациентов с развитой стадией первичной открытоугольной глаукомы (р< 0,05).

    Сравнительный анализ полученных данных показал, что концентрация трансформирующего фактора роста-β 1 во внутриглазной жидкости пациентов с развитой стадией ПОУГ более чем в 3 раза выше значения показателя у пациентов контрольной группы. Графически данные представлены на рис. 1.

    При определении содержания и статистической обработке полученных данных было показано, что концентрация TGF-β 2 во внутриглазной жидкости пациентов контрольной группы была статистически значимо более низкой, чем в исследуемой биологической жидкости у пациентов с развитой стадией первичной открытоугольной глаукомы (р< 0,05).

    Сравнительный анализ полученных данных показал, что концентрация трансформирующего фактора роста-β 2 во внутриглазной жидкости пациентов с развитой стадией ПОУГ была в 1,4 раза выше значения показателя у пациентов контрольной группы. Графически данные представлены на рис. 2.

    При определении содержания и статистической обработке полученных данных было показано, что концентрация TGF-β 3 во внутриглазной жидкости пациентов контрольной группы была статистически значимо более низкой, чем в исследуемой биологической жидкости у пациентов с развитой стадией первичной открытоугольной глаукомы (р< 0,05).

    Сравнительный анализ полученных данных показал, что концентрация трансформирующего фактора роста-β 3 во внутриглазной жидкости пациентов с развитой стадией ПОУГ была более чем 6 раз выше значения показателя у пациентов контрольной группы и достоверно от него отличалась. Графически данные представлены на рис. 3.

    Проведенный корреляционный анализ содержания изучаемых биологически активных веществ во внутриглазной жидкости пациентов с развитой стадией ПОУГ позволил выявить следующие закономерности. Были выявлены прямые достоверные коррелятивные взаимосвязи между TGF-β 1 и TGF-β 2 (r=0,41, p< 0,03), между TGF-β 1 и TGF-β 3 (r=0,83, p< 0,004 ) и между TGF-β 2 и TGF-β 3 (r=0,35, p< 0,04).

    Установленные в исследовании корреляционные взаимосвязи между изучаемыми показателями свидетельствуют о сопряженности нарастания концентраций представителей суперсемейства трансформирующих факторов роста – бета в механизмах развития глаукоматозного процесса.

    Полученные в исследовании данные свидетельствуют о наличии нарушений цитокиновой регуляции в механизмах развития ПОУГ. Установлено, что в патогенезе первичной открытоугольной глаукомы определяется достоверное нарастание во внутриглазной жидкости концентраций представителей суперсемейства трансформирующих факторов роста – бета, цитокинов, обладающих рядом свойств, таких как противовоспалительная активность, способность активировать процессы пролиферации, клеточного роста, синтез белков внеклеточного матрикса и др. [18-20].

    Указанное подтверждает результаты немногочисленных исследований последних лет, в которых рассматривается роль этого класса факторов роста в патогенезе ПОУГ, однако основной акцент в этих научных публикациях делается на изменения содержания TGF-β 2 [1, 9, 22, 23, 25].

    В то же время в настоящем исследовании установлено однонаправленное, взаимосвязанное нарастание концентраций во внутриглазной жидкости TGF-β 1 (более чем в 3 раза), TGF-β 2 (в 1,4 раза) и TGF-β 3 (более чем в 6 раз). Указанное в совокупности с результатами собственных исследований и данными научной литературы [1, 2, 6, 8, 14], свидетельствующими об изменении содержания и баланса биологически активных веществ, обладающих провоспалительными свойствами в средах глаза, позволяет предполагать развитие локального воспаления в патогенезе ПОУГ, которое сопровождается активацией сигнальных путей, направленных на повышение синтеза трансформирующих факторов роста. Данные процессы можно рассматривать как направленные на компенсацию последствий развития местного деструктивно-воспалительного процесса, однако они могут приводить к избыточной активации синтеза белков внеклеточного матрикса и его ремоделированию в трабекулярной сети, что увеличивает сопротивление оттоку внутриглазной жидкости и способствует внутриглазного давления и играет значимую роль в патогенезе ПОУГ.

    Представляется интересным для дискуссии выявленный в исследовании факт о том, что если рассматривать увеличение концентраций изучаемых факторов роста в абсолютных значениях, то наибольшее повышение концентраций установлено для TGF-β 2, в то же время при исходно низких значениях в контрольной группе концентрации TGF-β 3 при ПОУГ повышаются более чем в 6 раз, что позволяет сделать заключение о необходимости углубленного изучения роли этого цитокина в механизмах развития патологического процесса.

    Заключение

    Установленное сопряженное нарастание концентраций изучаемых представителей суперсемейства трансформирующих факторов роста-бета, обладающих противовоспалительной активностью, способностью стимулировать процессы пролиферации, клеточного роста, синтез белков внеклеточного матрикса и др., свидетельствует об их значимости в механизмах развития ПОУГ.