Патогенетическое обоснование применения кверцетина (липофлавона) у больных с диабетической ретинопатией

     К основным патогенетическим механизмам развития ретинопатии (стимуляция формирования микроаневризм и ремоделирования капиллярной сети с последующей ишемией) относится цитокиновый дисбаланс, включающий возрастание уровня эндотелина (Et) даже у пациентов с коротким стажем течения сахарного диабета (СД) [2, 3, 12, 13]. Один из цитокинов – интерлейкин 1β (IL-1β) играет ключевую роль в иммуногенезе и участвует в процессах взаимодействия иммунной, эндокринной и нервной систем [1, 6]. Он также стимулирует функциональную активность фибробластов, синтез фибронектина, коллагена, а также адгезию нейтрофилов и эозинофилов к сосудистому эндотелию, может выступать в качестве индуктора деградации коллагена роговичными фибробластами в культуре клеток [14]. IL-1β активирует хемокины IL-8, GROα и MIP-1α, которые посредством активации нейтрофилов и увеличения миграции эозинофилов способствуют хронизации воспаления в тканях глаза [13]. В научной литературе имеется небольшое количество публикаций, свидетельствующих о влиянии препаратов группы флавоноидов (кверцетина) на биологические эффекты цитокинов [16].

    Флавоноиды (кверцетин) относятся к нетоксичным полифенольным соединениям – способным обрывать цепные свободнорадикальные реакции, изменять активность различных ферментов, прямо и опосредованно (через антиоксидантный эффект) модулировать цитокиновый потенциал и др. [8, 20].

    Кверцетин обладает свойствами ингибитора ряда оксидазных ферментов, мощного антиоксиданта, препарата, способствующего нейтрализации окиси азота в ишемизированных тканях и соответственно выраженным мембрано-стабилизирующим действием [8].

    В ряде исследований выявлена способность кверцетина действовать в качестве ингибитора IL-1стимулированной секреции активированными клетками IL-6 и ряда биологически активных веществ [15]. Logvinov S.V. с соавт. [11] доказано позитивное влияние кверцетина на кровоснабжение сетчатки.

    Обнаружено ингибирующее влияние кверцетина на активность редуктазы в эпителии роговицы, радужной оболочке глаза и хрусталике. В последние годы установлено, что флавоноиды защищают клетки ганглии и эпителиальные клетки сетчатки от негативного влияния активных форм кислорода [16].

    Доказано, что действие кверцетина связано не только за счет антиоксидантного эффекта, но и за счет резкого торможения деградации мембранных фосфолипидов и уменьшения накопления свободных жирных кислот. При этом кверцетин способен обрывать свободнорадикальные реакции непосредственно в сосудистой стенке [8]. Perez-Vizcaino F. с соавт. [21] установлено, что кверцетин оказывает сосудорасширяющее действие и уменьшает ремоделирование сосудистой стенки, а также оказывает дифференцированное влияние на апоптоз гладкомышечных клеток артерий. По данным Donnini S. с соавт. [10] кверцетин способен модулировать регенерацию клеток сосудистого эндотелия.

    В небольшом ряду водорастворимых форм кверцетина особое место занимает липофлавон – кверцетин, включенный в уникальную систему доставки – липосому [9]. Указанная лекарственная форма позволяет добиться активной пенетрации кверцетина в патологический очаг благодаря высокой биодоступности липосомальной формы доставки, синергизма эффектов кверцетина и липосомальной формы фосфатидилхолина, что сопровождается достоверным усилением антиоксидантного, цитопротекторного и эндотелийпротекторного эффекта [5].

    ЦЕЛЬ

    Определить влияние кверцетина (липофлавона) на дисбаланс цитокинового гомеостаза у больных с различными формами диабетической ретинопатии.

    МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

    Материалом исследования служила сыворотка крови пациентов с СД, исследования проводились in vitro. Обследовано 119 пациентов с диабетической ретинопатией (ДР): 1-я группа – 14 пациентов с непролиферативной ретинопатией (НДР), 2-я группа – 39 пациентов с препролиферативной ретинопатией (ППДР), 3-ю группу составили 42 пациента с пролиферативной ретинопатией (ПДР). Контролем служили 24 здоровых донора в соответствующем возрастном диапазоне. Концентрацию цитокинов IL-1β и IL-4 в сыворотке крови и культуральной среде культуры клеток определяли иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов (ООО «Цитокины» IL-1β , протеиновый контур – TNF-α, IL-4).

    Оценка результатов осуществляется фотометрически.

    Проводились также эксперименты с определением уровня TNF-α в культуральной среде без и с преинкубацией культивируемых клеток с раствором глюкозы, инсулина, липополисахарида (LPS) [17, 22].

    РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

     Липофлавон-зависимая динамика уровня цитокинов в культуральной жидкости культуры мононуклеарных клеток пациентов 1-й, 2-й и 3-й групп представлена в табл.1. В культуральной среде культуры мононуклеарных клеток у пациентов 1-й группы уровень цитокина IL-1β был значительно ниже, чем в системном кровотоке у здоровых лиц (контроль) и составил 13,01±0,36 пг/мл. В эксперименте 2 (IL-1β) под влиянием введения в культуральную среду 5,5 ммоль/л глюкозы исследованный показатель возрастал на 33,8% (р<0,001), а в культуральной экспериментальной модели с липофлавоном (эксперимент 3(IL1β)) – статистически значимо снижался на 14,4% (р<0,01).

    У пациентов 2-й и 3-й групп исходный (в эксперименте 1 (IL-1β)) уровень IL-1β соответственно на 95,7% (р2<0,001) и 148,0% (р2<0,001) был выше, чем у пациентов 1-й группы и статистически значимо не менялся под влиянием введения в культуральную среду глюкозы. Можно предположить, что у пациентов СД с более длительным стажем течения заболевания и с более высокими цифрами гипергликемии имеет место полная реализация in vivo глюкозо-индуцированной функциональной активности мононуклеаров, что и проявляется отсутствием глюкозо-индуцированного синтеза IL-1β в витральном культуральном эксперименте. Вместе с тем у пациентов 2-й и 3-й группы сохраняется липофлавон-зависимое снижение синтеза IL-1β в культуре клеток: в эксперименте 3 (IL-1β)) уровень IL-1β снижается соответственно на 17,3% (р<0,01) и 8,6% (р<0,05).

    Влияние липофлавона на глюкозо-индуцированный уровень IL-4 в культуральной среде культуры мононуклеарных клеток у исследуемых пациентов (in vitro) представлено в табл. 2. В культуральной среде культуры мононуклеарных клеток как у пациентов 2-й, так и у пациентов 3-й группы исходный (в эксперименте 1(IL-4)) уровень цитокина IL-4 в 1,6 раза (р2<0,001) был выше, чем у пациентов 1-й группы, и статистически значимо не менялся в экспериментальных культуральных моделях с глюкозой и липофлавоном. У пациентов 1-й группы динамики исследованного показателя под влиянием глюкозы также не обнаружено, но в эксперименте 3(IL-4) под влиянием липофлавона исследованный показатель на 8,8% (р1<0,02) был ниже в сравнении с экспериментом 2(IL-4) у пациентов той же группы.

    Таким образом, у пациентов с непролиферативной ретинопатией модулирующее влияние липофлавона на глюкозо-индуцированный синтез мононуклеарными лейкоцитами IL-4 сохраняется.

    Влияние липофлавона на глюкозо-индуцированный уровень – tumor nеcrosis factor (TNF-α) – в культуральной среде культуры мононуклеарных клеток у исследуемых больных (in vitro) представлено в табл. 3.

    Нами установлено, что в культуральной среде культуры мононуклеарных клеток у пациентов 2-й и 3-й групп исходный (в эксперименте 1 (TNF-α)) уровень цитокина TNF-α на 19,1-39,3% (р2<0,001) выше, чем у пациентов 1-й группы. В экспериментальных культуральных моделях с глюкозой динамика исследованного показателя выявлена была только у пациентов 1-й и 2-й групп: уровень TNF-α в культуральной среде возрастал соответственно на 11,4% (р<0,05) и 14,3% (р<0,01). В эксперименте 3(TNF-α) под влиянием введения в культуральную среду липофлавона уровень TNF-α у пациентов 1-й группы снижался в сравнении с экспериментом 2(TNF-α) на 19,0% (р1<0,001), у пациентов 2-й и 3-й групп – соответственно на 22,7% (р<0,02, р1<0,001) и 21,8% (р<0,01, р1<0,001).

    Таким образом, нами установлено, что под влиянием гипергликемии у пациентов СД с диабетической ретинопатией может возрастать лейкоцито (лимфоцито)-зависимый уровень провоспалительных цитокинов местно (in loko morbi, куда лейкоциты активно мигрируют из общего кровотока), на уровне тканей глаза. Подтверждением этой мысли служит то, что в отличие от эритроцитов и тромбоцитов лейкоциты в русле крови не выполняют никаких функций, кровоток служит лишь для их транспорта; функционируют лейкоциты в органах и тканях, куда они мигрируют. В кровотоке же находится не более 1-2% всех лейкоцитов организма [4].

    С другой стороны, представленные результаты исследований, по нашему мнению, могут расцениваться как патофизиологическое обоснование использования липофлавона для коррекции дисбаланса цитокинового гомеостаза у пациентов с диабетической ретинопатией, прежде всего – препролиферативной и пролиферативной стадии.

    По данным некоторых авторов инсулиновые рецепторы идентифицированы на эритроцитах, фибробластах, нейтрофилах, моноцитах, В-лимфоцитах, а также на активированных Т-лимфоцитах, перитонеальных макрофагах и ряде других клеток [18, 19]. Под влиянием главного лекарственного средства – инсулина – у пациентов СД возрастает синтез эндотелиальными клетками (также имеющими рецепторы к инсулину) ET-1, возрастает синтез vWf, подавляется фибринолитическая активность клеток эндотелия, что приводит к повреждению эндотелия несбалансированно высоким образованием фибрина и тромбина, а также к формированию условий для агрегации тромбоцитов [7].

    В культуре клеток адипоцитов некоторыми авторами в условиях экспериментальной модели острого воспаления установлено, что синтезируемые клетками цитокины снижают активацию на клетках инсулиновых рецепторов и уменьшают стимулированное инсулином поглощение клетками глюкозы. По мнению авторов, указанный «цитокин-зависимый» механизм может лежать в основе формирования инсулинорезистентности у пациентов СД [19].

    Указанные факты, по нашему мнению, являются весомой научной аргументацией для проведения научных исследований по проблеме инсулин-зависимой функциональной (включая цитокин-продуцирующей) активности мононуклеарных лейкоцитов, а также возможности использования липофлавона для коррекции выявленных инсулин-опосредованных нарушений.

     Результаты исследования липофлавон-зависимой динамики уровня цитокинов в культуральной жидкости культуры мононуклеарных клеток пациентов 1-й, 2-й и 3-й групп представлены в табл. 4. и 5.

    В культуральной среде культуры мононуклеарных клеток у пациентов 1-й группы уровень цитокина IL-1β в инкубационных экспериментальных моделях с инсулином и липофлавоном существенно не меняется. У пациентов 2-й и 3-й групп уровень IL-1β под влиянием инсулина статистически значимо возрастает на 13,7–15,4% (р<0,01). Можно предположить, что у пациентов СД с более длительным стажем течения заболевания формируется инсулинзависимый механизм формирования цитокинового (IL-1β) дисбаланса.

    Также установлено, что только у пациентов с препролиферативной и пролиферативной ретинопатией в эксперименте с липофлавоном выявлена не только отмена инсулинзависимого повышения синтеза мононуклеарами IL-1β (на 22,0–27,0%, р1<0,001), но и достоверное снижение независимого от инсулина синтеза цитокина мононуклеарными лейкоцитами (р<0,001).

    В культуральной среде культуры мононуклеарных клеток динамики уровня цитокина IL-4 под влиянием инсулина, а также липофлавона нами не обнаружено (табл. 5).

    Влияние липофлавона на инсулинзависимый уровень tumor nеcrosis factor (TNF-α) в культуральной среде культуры мононуклеарных клеток у исследуемых пациентов (in vitro) представлено в табл. 6. В экспериментальных культуральных моделях с инсулином динамики исследованного показателя у пациентов 1-й, 2-й и 3-й групп не выявлено. В эксперименте 3 (TNF-α) под влиянием введения в культуральную среду липофлавона уровень TNF-α у пациентов 1-й группы снижается в сравнении с экспериментом 2 (TNF-α) на 10,2% (р1<0,05), у пациентов 2-й и 3-й групп – соответственно на 12,1% (р1<0,05) и 14,5% (р1<0,01). Указанные факты позволяют утверждать, что инсулинзависимого возрастания синтеза TNF-α мононуклеарными лейкоцитами пациентов с ДР не выявлено.

    Таким образом, нами установлено, что под влиянием инсулина у пациентов СД с диабетической ретинопатией препролиферативной и пролиферативной стадии может возрастать лейкоцито (лимфоцито)-зависимый уровень провоспалительного цитокина IL-1β, что, по нашему мнению, может расцениваться как подтверждение научной обоснованности использования липофлавона для коррекции не только глюкозо-опосредованного, но и инсулинзависимого дисбаланса цитокинового гомеостаза у пациентов с диабетической ретинопатией, прежде всего – препролиферативной и пролиферативной стадий.

    ВЫВОДЫ

    У пациентов с диабетической ретинопатией выявленное нарастание синтеза мононуклеарными лейкоцитами провоспалительных цитокинов IL-1β и TNF-α по мере нарастания степени тяжести ангиопатии может быть расценено как важная патогенетическая «составляющая» прогрессирования ангиопатии.

    Установлено, что при диабетической ретинопатии существует статистически достоверное влияние кверцетина (липофлавона) на функциональную активность мононуклеарных клеток: при культивировании клеток в присутствии кверцетина (липофлавона) уровень цитокинов IL-1β и TNF-α в культуральной среде снижается, что позволяет рекомендовать его для лечения ДР.

    Существенным механизмом прогрессирования диабетической ретинопатии является гипергликемия– и инсулинзависимый лейкоцито(лимфоцито)-опосредованный механизм формирования цитокинового дисбаланса.

    

    Сведения об авторах

    Иванова Нанули Викторовна – доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой офтальмологии ГУ «Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского»

    Ярошева Наталья Анатольевна – к.м.н., доцент кафедры офтальмологии ГУ «Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского». Чистякова Светлана Владимировна – к.м.н., доцент кафедры офтальмологии ГУ «Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского».

    Ярошева Любовь Михайловна – главный специалист МЗ Крыма по специальности «Офтальмология». Микрохирургический офтальмологический центр ГБУЗ РК «КБ им. Н. А. Семашко».