Онлайн доклады

Онлайн доклады

Клинические случаи в офтальмологии

Клинические случаи в офтальмологии

Впервые выявленная глаукома: проблемы и возможности

Впервые выявленная глаукома: проблемы и возможности

Пироговский офтальмологический форум 2023

Пироговский офтальмологический форум 2023

Сателлитные симпозиумы в рамках Пироговского офтальмологического форума 2023

Сателлитные симпозиумы в рамках Пироговского офтальмологического форума 2023

Сателлитные симпозиумы в рамках III Всероссийской конференции с международным участием «Воспаление глаза 2023»

Сателлитные симпозиумы в рамках III Всероссийской конференции с международным участием «Воспаление глаза 2023»

Проблемные вопросы глаукомы: Искусственный интеллект в диагностике и мониторинге XII Международный симпозиум

Проблемные вопросы глаукомы: Искусственный интеллект в диагностике и мониторинге XII Международный симпозиум

Сателлитные симпозиумы в рамках 23-го Всероссийского научно-практического конгресса с  международным участием «Современные технологии  катарактальной, рефракционной и роговичной хирургии»

Сателлитные симпозиумы в рамках 23-го Всероссийского научно-практического конгресса с международным участием «Современные технологии катарактальной, рефракционной и роговичной хирургии»

NEW ERA Способы трансcклеральной фиксации ИОЛ

NEW ERA Способы трансcклеральной фиксации ИОЛ

Сателлитные симпозиумы в рамках XVI Российского общенационального офтальмологического форума

Сателлитные симпозиумы в рамках XVI Российского общенационального офтальмологического форума

Ромашка Фёдорова: 35 лет в движении. Всероссийская научно-практическая конференция

Ромашка Фёдорова: 35 лет в движении. Всероссийская научно-практическая конференция

Сателлитные симпозиумы в рамках Северо-Кавказского офтальмологического саммита

Сателлитные симпозиумы в рамках Северо-Кавказского офтальмологического саммита

NEW ERA Новые молекулы в лечении макулярной патологии

NEW ERA Новые молекулы в лечении макулярной патологии

Сателлитные симпозиумы в рамках XXIX Международного офтальмологического конгресса «Белые ночи»

Сателлитные симпозиумы в рамках XXIX Международного офтальмологического конгресса «Белые ночи»

Сателлитные симпозиумы в рамках Всероссийской научно-практической конференции с международным участием  «Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия»

Сателлитные симпозиумы в рамках Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия»

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Сателлитные симпозиумы в рамках 20 Всероссийской научно-практической конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии»

Сателлитные симпозиумы в рамках 20 Всероссийской научно-практической конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии»

NEW ERA Особенности имплантации мультифокальных ИОЛ

NEW ERA Особенности имплантации мультифокальных ИОЛ

XXX Научно-практическая конференция офтальмологов  Екатеринбургского центра МНТК «Микрохирургия глаза»

XXX Научно-практическая конференция офтальмологов Екатеринбургского центра МНТК «Микрохирургия глаза»

Прогрессивные технологии микрохирургии глаза в реальной клинической практике. Научно-практическая конференция

Прогрессивные технологии микрохирургии глаза в реальной клинической практике. Научно-практическая конференция

Пироговский офтальмологический форум

Пироговский офтальмологический форум

Глаукома. Избранные вопросы патогенеза, профилактики, диагностики, лечения. Всероссийская офтальмологическая конференция

Глаукома. Избранные вопросы патогенеза, профилактики, диагностики, лечения. Всероссийская офтальмологическая конференция

Терапия глаукомы. Практический подход и поиск решений в дискуссии

Терапия глаукомы. Практический подход и поиск решений в дискуссии

NEW ERA Хирургическое лечение глаукомы: НГСЭ

NEW ERA Хирургическое лечение глаукомы: НГСЭ

Сателлитные симпозиумы в рамках 22-го Всероссийского научно-практического конгресса «Современные технологии катарактальной, рефракционной и роговичной хирургии»

Сателлитные симпозиумы в рамках 22-го Всероссийского научно-практического конгресса «Современные технологии катарактальной, рефракционной и роговичной хирургии»

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ - 2022

Сателлитные симпозиумы в рамках РООФ - 2022

Современные достижения лазерной офтальмохирургии Всероссийский научный симпозиум

Современные достижения лазерной офтальмохирургии Всероссийский научный симпозиум

Юбилейная X научно-практическая конференция, посвященная 35-летию Чебоксарского филиала ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова»

Юбилейная X научно-практическая конференция, посвященная 35-летию Чебоксарского филиала ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова»

NEW ERA Хирургия осложнённой катаракты

NEW ERA Хирургия осложнённой катаракты

NEW ERA Оптическая когерентная томография. Критерии активности макулярной неоваскуляризации

NEW ERA Оптическая когерентная томография. Критерии активности макулярной неоваскуляризации

NEW ERA Особенности лечения отслойки сетчатки

NEW ERA Особенности лечения отслойки сетчатки

Шовная фиксация ИОЛ

Мастер класс

Шовная фиксация ИОЛ

Сателлитные симпозиумы в рамках I Дальневосточного офтальмологического саммита

Сателлитные симпозиумы в рамках I Дальневосточного офтальмологического саммита

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Рефракционная хирургия хрусталика. Точно в цель. Научно-практический семинар

Восток - Запад 2022 Международная конференция по офтальмологии

Восток - Запад 2022 Международная конференция по офтальмологии

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Вебинар

Целевые уровни ВГД в терапии глаукомы

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Сателлитные симпозиумы в рамках научной конференции «Невские горизонты - 2022»

Новые технологии в офтальмологии 2022

Новые технологии в офтальмологии 2022

ОКТ: новые горизонты

Сателлитный симпозиум

ОКТ: новые горизонты

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Вебинар

Превентивная интрасклеральная фланцевая фиксация ИОЛ при подвывихе хрусталика

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лечение глаукомы: инновационный вектор - 2022. III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Вебинар компании «Rayner»

Вебинар компании «Rayner»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Цикл онлайн дискуссий компании «Акрихин» «О глаукоме и ВМД в прямом эфире»

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Вебинар

Алгоритм ведения пациентов с астенопией после кераторефракционных операций

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Сателлитный симпозиум

Cовременные технологии диагностики патологий заднего отдела глаза

Вебинары компании  «Акрихин»

Вебинары компании «Акрихин»

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Вебинар

Снижение концентрации «Бримонидина», как новое решение в терапии у пациентов с глаукомой

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Конференция

Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии: в фокусе – роговица

XIX Конгресс Российского глаукомного общества  «19+ Друзей Президента»

XIX Конгресс Российского глаукомного общества «19+ Друзей Президента»

Пироговский офтальмологический форум

Пироговский офтальмологический форум

Кератиты, язвы роговицы

Вебинар

Кератиты, язвы роговицы

Актуальные вопросы офтальмологии

Вебинар

Актуальные вопросы офтальмологии

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Сателлитный симпозиум

Всероссийский консилиум. Периоперационное ведение пациентов с глаукомой

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Трансплантация роговично-протезного комплекса у пациента с васкуляризированным бельмом роговицы

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Конференция

Новые технологии в офтальмологии. Посвящена 100-летию образования Татарской АССР

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Конференция

Особенности нарушения рефракции в детском возрасте Межрегиональная научно-практическая конференция

Клинические случаи в офтальмологии

Клинические случаи в офтальмологии

Онлайн доклады

Онлайн доклады

Впервые выявленная глаукома: проблемы и возможности

Впервые выявленная глаукома: проблемы и возможности

Сателлитные симпозиумы в рамках Пироговского офтальмологического форума 2023

Сателлитные симпозиумы в рамках Пироговского офтальмологического форума 2023

Пироговский офтальмологический форум 2023

Пироговский офтальмологический форум 2023

Сателлитные симпозиумы в рамках III Всероссийской конференции с международным участием «Воспаление глаза 2023»

Сателлитные симпозиумы в рамках III Всероссийской конференции с международным участием «Воспаление глаза 2023»

Проблемные вопросы глаукомы: Искусственный интеллект в диагностике и мониторинге XII Международный симпозиум

Проблемные вопросы глаукомы: Искусственный интеллект в диагностике и мониторинге XII Международный симпозиум

Сателлитные симпозиумы в рамках 23-го Всероссийского научно-практического конгресса с  международным участием «Современные технологии  катарактальной, рефракционной и роговичной хирургии»

Сателлитные симпозиумы в рамках 23-го Всероссийского научно-практического конгресса с международным участием «Современные технологии катарактальной, рефракционной и роговичной хирургии»

NEW ERA Способы трансcклеральной фиксации ИОЛ

NEW ERA Способы трансcклеральной фиксации ИОЛ

Сателлитные симпозиумы в рамках XVI Российского общенационального офтальмологического форума

Сателлитные симпозиумы в рамках XVI Российского общенационального офтальмологического форума

Ромашка Фёдорова: 35 лет в движении. Всероссийская научно-практическая конференция

Ромашка Фёдорова: 35 лет в движении. Всероссийская научно-практическая конференция

Сателлитные симпозиумы в рамках Северо-Кавказского офтальмологического саммита

Сателлитные симпозиумы в рамках Северо-Кавказского офтальмологического саммита

NEW ERA Новые молекулы в лечении макулярной патологии

NEW ERA Новые молекулы в лечении макулярной патологии

Сателлитные симпозиумы в рамках XXIX Международного офтальмологического конгресса «Белые ночи»

Сателлитные симпозиумы в рамках XXIX Международного офтальмологического конгресса «Белые ночи»

Сателлитные симпозиумы в рамках Всероссийской научно-практической конференции с международным участием  «Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия»

Сателлитные симпозиумы в рамках Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Лазерная интраокулярная и рефракционная хирургия»

Все видео...
 Реферат RUS  Реферат ENG  Литература  Полный текст
УДК:

617.713

DOI: https:/doi.org/10.25276/0235-4160-2021-2-32-39

Переживаемость кератоцитов и эндотелиальных клеток заднего послойного трансплантата роговицы, культивированных в модифицированной консервационной среде


    Актуальность

    
Рис. 1. Морфологическая картина клеточной культуры кератоцитов: а) 3 сутки, контрольная группа; б) – 3 сутки, экспериментальная группа; в) – 14 сутки, контрольная группа; г) – 14 сутки, экспериментальная группа Световая фазово-контрастная микроскопия, ув. 100х.
Fig. 1. Morphological picture of the cell culture of keratocytes: а) 3rd day, the control group; б) 3rd day, the experimental group; d) 14th days, control group; г) 14th day, the experimental group. Light phase contrast microscopy, magnification – 100x
Рис. 1. Морфологическая картина клеточной культуры кератоцитов: а) 3 сутки, контрольная группа; б) – 3 сутки, экспериментальная группа; в) – 14 сутки, контрольная группа; г) – 14 сутки, экспериментальная группа Световая фазово-контрастная микроскопия, ув. 100х. Fig. 1. Morphological picture of the cell culture of keratocytes: а) 3rd day, the control group; б) 3rd day, the experimental group; d) 14th days, control group; г) 14th day, the experimental group. Light phase contrast microscopy, magnification – 100x

Рис. 2. Иммуноцитохимическая картина культуры кератоцитов: а), б) – экспрессия Кератокана (красный цвет) и Люмикана (зеленый цвет) в), г) – экспрессия α-гладкомышечного актина (зеленый цвет); а), в) – контрольная группа, б), г) – экспериментальная группа. Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра контрастированы бис-бензимид (Hoechst 33258), ув. 100х
<br /><br />    Fig. 2. Immunocytochemical picture of the culture of keratocytes: а), в) – expression of Keratocan (red color) and Lumikan (green color); в), г) – expression of α-smooth muscle actin (green color); а), в) – control group, б), г) – experimental group. Immunocytochemical staining, laser scanning confocal microscopy, nuclei contrasted with bis-benzimide (Hoechst 33258), magnification – 100x
Рис. 2. Иммуноцитохимическая картина культуры кератоцитов: а), б) – экспрессия Кератокана (красный цвет) и Люмикана (зеленый цвет) в), г) – экспрессия α-гладкомышечного актина (зеленый цвет); а), в) – контрольная группа, б), г) – экспериментальная группа. Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра контрастированы бис-бензимид (Hoechst 33258), ув. 100х

    Fig. 2. Immunocytochemical picture of the culture of keratocytes: а), в) – expression of Keratocan (red color) and Lumikan (green color); в), г) – expression of α-smooth muscle actin (green color); а), в) – control group, б), г) – experimental group. Immunocytochemical staining, laser scanning confocal microscopy, nuclei contrasted with bis-benzimide (Hoechst 33258), magnification – 100x
Начиная примерно с 2000 г. в клиническую практику начинает активно внедряться техника эндотелиальной кератопластики, используемая для послойной замены пораженных задних слоев роговицы [1]. К настоящему времени предложено несколько модификаций эндотелиальной кератопластики, одна из которых – задняя автоматизированная послойная кератопластика (ЗАПК или DSAEK), получила наибольшее распространение в клинике для лечения больных с патологией эндотелия роговицы различного генеза [2–4]. Значительное количество усилий исследователей было направлено на разработку и внедрение технологий получения ультратонкого (менее 120–130 микрон) трансплантата, как обеспечивающего более высокие зрительные функции по сравнению со стандартными трансплантатами, имеющими большую толщину.

    Известен факт посмертной гипергидратации донорских роговиц, находящихся в стандартных консервационных средах, что не позволяет получать оптимальную толщину трансплантата с использованием техники одинарного прохода микрокератома. Однако до настоящего времени как в России, так и за рубежом отсутствуют консервационные среды, обеспечивающие оптимальную степень содержания влаги в донорской роговице. В связи с этим нами разработана оригинальная рецептура среды, служащая для дегидратации донорских роговиц на этапе консервации [5]. В ранее проведенных исследованиях установлен факт более оптимальной гидратации трупной донорской роговицы, хранившейся в предложенной среде [6]. Однако вопросы переживаемости кератоцитов и клеток заднего эпителия роговицы, консервированной в данной среде, ранее не изучались.

    

    Цель

    Сравнить переживаемость кератоцитов и клеток заднего эпителия (эндотелия) донорской роговицы человека в усовершенствованной среде для её оптимальной гидратации перед выкраиванием ультратонкого заднего послойного трансплантата методом одинарного прохода микрокератома.

    

    Материал и методы

    Получение клеточных культур 2D культура кератоцитов

    
Рис. 3. Иммуноцитохимическая картина культуры кератоцитов: а), б) – экспрессия цитохрома С (красный цвет) и BAX (зеленый цвет) в), г) – экспрессия Каспазы 8 (зеленый цвет) и Каспазы 3 (красный цвет); а), в) – контрольная группа, б), г) – экспериментальная группа. Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра контрастированы бис-бензимид (Hoechst 33258), ув. 100х
Fig. 3. Immunocytochemical picture of the culture of keratocytes: а), б) – expression of cytochrome C (red color) and BAX (green color); в), г) – expression of Caspase 8 (green color) and Caspase 3 (carse color); а), в) – control group, б), г) – experimental group. Immunocytochemical staining, laser scanning confocal microscopy, nuclei contrasted with bis-benzimide (Hoechst 33258), magnification – 100x
Рис. 3. Иммуноцитохимическая картина культуры кератоцитов: а), б) – экспрессия цитохрома С (красный цвет) и BAX (зеленый цвет) в), г) – экспрессия Каспазы 8 (зеленый цвет) и Каспазы 3 (красный цвет); а), в) – контрольная группа, б), г) – экспериментальная группа. Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра контрастированы бис-бензимид (Hoechst 33258), ув. 100х Fig. 3. Immunocytochemical picture of the culture of keratocytes: а), б) – expression of cytochrome C (red color) and BAX (green color); в), г) – expression of Caspase 8 (green color) and Caspase 3 (carse color); а), в) – control group, б), г) – experimental group. Immunocytochemical staining, laser scanning confocal microscopy, nuclei contrasted with bis-benzimide (Hoechst 33258), magnification – 100x

Рис. 4. Иммуноцитохимическая картина клеток эндотелия роговицы: экспрессия Na/K АТФазы (красный цвет), ZO – 1 (зеленый цвет); а) – контрольная группа, б) – экспериментальная группа. Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра контрастированы бис-бензимид (Hoechst 33258), ув. 100х
Fig. 4. Immunocytochemical picture of corneal endothelial cells: Na / K ATPase expression (red color), ZO – 1 (green color); а) – control group, б) – experimental group. Immunocytochemical staining, laser scanning confocal microscopy, nuclei contrasted with bis-benzimide (Hoechst 33258), magnification – 100x
Рис. 4. Иммуноцитохимическая картина клеток эндотелия роговицы: экспрессия Na/K АТФазы (красный цвет), ZO – 1 (зеленый цвет); а) – контрольная группа, б) – экспериментальная группа. Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра контрастированы бис-бензимид (Hoechst 33258), ув. 100х Fig. 4. Immunocytochemical picture of corneal endothelial cells: Na / K ATPase expression (red color), ZO – 1 (green color); а) – control group, б) – experimental group. Immunocytochemical staining, laser scanning confocal microscopy, nuclei contrasted with bis-benzimide (Hoechst 33258), magnification – 100x
Культура кератоцитов получена из Глазного тканевого банка ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Фёдорова» Минздрава России.

    Культивирование кератоцитов проводили в двух опытных группах: контрольная группа – культивирование в стандартной культуральной бессывороточной среде (DMEM/F12 (Sigma Aldrich, США), Фактор роста фибробластов – 10 нг/мл (ПанЭко, Россия), эпителиальный фактор роста – 5 нг/мл (ПанЭко, Россия), L-аскорбиновая кислота – 10 нг/мл (Sigma aldrich, США), 1% раствор антибиотиков (Thermofisher scientific, США), L-глутамин – 2 мМ (Thermofisher scientific, США)). В экспериментальной группе использовали оригинальную среду для консервации заднего послойного трансплантата донорской роговицы [5]. Для изучения воздействия на кератоциты использовали 2D клеточную культуру 3 пассажа. Посевная концентрация кератоцитов составила 4,2*104 клеток в 1 мл, культивирование проводили в чашках Петри 60 мм (SPL, Южная Корея), при стандартных условиях (37 0С, 5% СО2), срок культивирования – 14 дней, смена среды каждые 3-е суток.

    Эндотелий роговицы

    Для изучения переживания эндотелия роговицы в культуральных растворах использовали 5 пар корнеосклеральных дисков из Глазного тканевого банка ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Фёдорова» Минздрава России. Средний возраст доноров составил 43±7 года, время от момента смерти до начала эксперимента не превышало 18 часов.

    Полученные корнеосклеральные диски очищали от переднего эпителия, используя офтальмологический скарификатор. Далее диски переносили в культуральные флаконы, с добавлением 15 мл питательной среды: контрольная группа – DMEM/F12 (Sigma aldrich, США), фетальная бычья сыворотка – 2% (Thermofisher scientific, США), раствор антибиотиков - 1% (Thermofisher scientific, США), L-глутамин – 2 мМ (Thermofisher scientific, США); экспериментальная группа – оригинальная среда. Культивирование проводили при стандартных условиях (37 0С, 5% СО2), срок культивирования составил 7 дней, смена среды каждые 3-е суток.

    Иммуноцитологическое исследование клеточных культур

    Для подтверждения клеточного фенотипа кератоцитов и эндотелия роговицы проводили иммуноцитохимический анализ: для кератоцитов изучали специфические маркеры – Кератокан (sc-66941; Santa Cruz, США), Люмикан (ab-168348; Abcam, Великобритания), для эндотелия роговицы – ZO-1 (ab-221546; Abcam, Великобритания) и Na/K АТФазу (sc-48345; Santa Cruz, США). Кроме того, оценивали экспрессию α-гладкомышечного актина (ab-7817; Abcam, Великобритания), данный маркер является неспецифичным для кератоцитов, но его обнаружение в культуре свидетельствует о переходе кератоцитов в миофибробласты. Также в 2D культуре кератоцитов оценивали апоптоз: для определения активации каспазного пути апоптоза изучали Каспазы 3 (ab-44976; Abcam, Великобритания) и 8 (ab-32397; Abcam, Великобритания), для активации митохондриального пути апоптоза изучали Цитохром С (ab-110325; Abcam, Великобритания) и BAX (ab-81083; Abcam, Великобритания).

    Спустя 14 суток культивирования кератоцитов и 7 суток культивирования корнеосклеральных дисков проводили их фиксацию в 10% нейтральном формалине (pH=7,0) в течение 15 мин при комнатной температуре, после чего трехкратно отмывали в растворе PBS (ПанЭко, Россия). Далее 2D культуру кератоцитов и корнеосклеральные диски обрабатывали 0,25 % раствором Triton X-100 (Thermofisher scientific, США) в течение 20 минут при комнатной температуре, с последующим трехкратным промыванием PBS. Инкубирование с первичными антителами проводили в течение 60 мин в темноте при комнатной температуре с последующим трехкратным промыванием PBS. Затем проводили инкубирование с вторичными антителами Alexa Fluor 488 (ab150113; Abcam, Великобритания) и Alexa Fluor 594 (ab 150080; Abcam, Великобритания) в течение 60 мин в темноте при комнатной температуре. Ядра клеток контрастировали Hoechst 33258 (ab 228550; Abcam, Великобритания) в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре. Изучение образцов проводили на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Olympus Fluoview FV 10i (Olympus, Япония).

    Изучение жизнеспособности клеток

    Жизнеспособность кератоцитов оценивали на проточном цитофлуориметре «CytoFlex» (Beckman Coulter, США) используя флуоресцентный краситель «Live and Dead» (ab 115347; Abcam, Великобритания) по протоколу, заявленному производителем. Определение индекса пролиферации проводили в автоматическом счетчике клеток «Luna II» (Logos Biosystems, Южная Корея) по стандартному протоколу.

    Для определения жизнеспособности эндотелиальных клеток роговицы так же использовали флуоресцентный краситель «Live and Dead», с последующим изучением препаратов на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе «Olympus Fluoview FV 10i» (Olympus, Япония).

    Морфологическая оценка эндотелия роговицы

     Морфологическую оценку и подсчет количества клеток проводили на растровом сканирующем электроном микроскопе «JSM-6000 PLUS» (Jeol, Япония) после соответствующей подготовки. Образцы после культивирования промывали 3-х кратно раствором PBS, далее проводили дегидратацию с использованием раствора ацетона в восходящей концентрации (10, 20, 30, 50,70,90,100х3) по 30 минут. Сушка в критической точке проводилась в парах CO2 при возрастающем давлении до 1250 psi при 37оС в течение 120 мин на приборе «Quorum EMS 850» (Quorum, Великобритания). Для обеспечения электронно-проходящего слоя дегидратированные образцы помещали на предметные столики для электронной микроскопии с последующим напылением золотом (толщина слоя 5 нм) с использованием «Smart Coater» (Jeol, Япония). Далее образцы располагали в камеру сканирующего электронного микроскопа, анализ осуществляли в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 15 кВ.

    Статистический анализ

    Статистическую обработку полученных данных проводили, используя методы описательной статистики с помощью программного обеспечения «Graph Pad Software Prisma 7».

    

    Результаты

    Качественная оценка роста и фенотипа 2D культуры кератоцитов

    Морфология кератоцитов в исследуемых группах была представлена схожими биполярными мезенхимоподобными клетками (рис. 1).

    При оценке пролиферации отметили слабую пролиферативную активность кератоцитов в обеих исследуемых группах в течение всего срока культивирования. Коэффициент пролиферации в экспериментальной группе составил 12,63%, в контрольной группе – 13,86%. Количество делящихся кератоцитов в обеих группах в разные сроки культивирования представлены в таблице 1. При сравнительном анализе кривой изменения количества клеток статистической разницы между группами выявлено не было, что может свидетельствовать об отсутствии у исследуемых составов сред стимуляции к пролиферации.

    При изучении жизнеспособности кератоцитов в течение всего срока культивирования, с использованием флуоресцентного красителя «Live and Dead», было выявлено отсутствие статистической разницы между группами (табл. 2).

    Иммуноцитохимическое окрашивание показало, что кератоциты активно экспрессируют Кератокан и Люмикан и не экспрессируют специфический маркер миофибробластов – α-гладкомышечный актин (рис. 2).

    В обеих группах выявили отсутствие экспрессии маркеров раннего апоптоза каспазного пути (Каспазы 3 и 8), а также митохондриального пути – Цитохрома С и BAX (рис. 3).

    Полученные результаты показали, что новое средство для консервации заднего послойного трансплантата донорской роговицы является нетоксичным и способствует сохранению уникального фенотипа кератоцитов.

    Качественная оценка роста и фенотипа эндотелия роговицы

    В обеих исследуемых группах спустя 7 дней культивирования отмечали потерю плотности клеток эндотелия, которая между группами была статистически недостоверной (табл. 3).

    При детекции живых и мертвых клеток флуоресцентным красителем значительных различий между группами также выявлено не было (табл. 4). Следует отметить, что потеря клеток в обеих группах не превышала 8%.

     Иммуноцитохимическое окрашивание спустя 7 дней культивирования показало наличие функциональных маркеров эндотелия ZO – 1 и Na/K АТФазы (рис. 4). Клеток, не экспрессирующих данные маркеры в обеих группах, обнаружено не было.

    При анализе морфологии клеток эндотелия роговицы на 7-е сутки культивирования с использованием электронной сканирующей микроскопии выявили клетки характерной гексагональной формы, а также группы клеток, утративших целостность клеточной мембраны и с ярко выраженным клеточным ядром, свидетельствующим об их нежизнеспособности (рис. 5).

    Полученные результаты показали, что разработанная среда для консервации заднего послойного трансплантата донорской роговицы способствует сохранению жизнеспособного и функционального эндотелия роговицы как минимум до 7 дней культивирования.

    

    Обсуждение

    В настоящее время ведется множество работ, направленных на получение ультратонкого трансплантата для задней послойной кератопластики, поскольку доказано, что минимизация количества остаточной стромы на трансплантате способствует значительному повышению зрительных функций в послеоперационном периоде [7, 8].

    На сегодня существует несколько методик получения ультратонкого трансплантата задних слоев роговицы, включающих в себя технику двойного реза микрокератомом, использование лазера, а также методику предварительной дегидратации донорской роговицы путем ее помещения в специальные среды.

    Применение техники двойного реза микрокератома способствует получению более равномерного трансплантата толщиной около 100 мкм [9]. Однако данная методика имеет высокий риск перфорации донорской роговицы. Кроме того, в проведенных исследованиях было показано, что отношение нежизнеспособных клеток эндотелия донорской роговицы к общему количеству эндотелиальных клеток в группе двойного реза составило 0,0145, а в группе с одним резом – 0,0028. Таким образом, проведение дополнительного реза донорской роговицы приводит к статистически значимому более высокому количеству поврежденных нежизнеспособных эндотелиальных клеток [10].

    Применение лазеров (преимущественно фемтосекундных) для выкраивания трансплантата задних слоев роговицы приобретает все большую популярность ввиду простоты методики и возможности получения равномерного трансплантата заданной толщины. Однако данная методика характеризуется более высокой потерей эндотелиальных клеток по сравнению с применением микрокератома [11]. Стоит отметить, что применение фемтосекундного лазера сопровождается вторичным индуцированным УФ-излучением, приводящему к излишнему накоплению перекисных радикалов в тканях. Эти радикалы оказывают повреждающее действие на клеточные (кератоциты, эндотелиоциты) и тканевые структуры стромы роговицы, что может провоцировать избыточную асептическую воспалительную регенеративную реакцию [12]

    Другим направлением получения ультратонких трансплантатов является предварительная дегидратация донорской роговицы непосредственно перед выкраиванием. Данная методика предполагает дополнительные манипуляции с переносом донорской роговицы в отдельную ёмкость со специальным раствором, что повышает риск контаминации донорского материала [13].

    В настоящее время нет ни одной научной работы, в которой проводится изучение апоптоза, а также изучаются хромосомные повреждения в кератоцитах и эндотелии донорских роговиц, хранившихся в различных консервационных средах перед выкраиванием с помощью традиционных методов (механический кератом, фемтосекундный лазер). Такие исследования представляют несомненный научный и практический интерес.

    Модифицированная среда для консервации заднего послойного трансплантата донорской роговицы [5] была сконструирована на основе ранее зарекомендовавшей себя среды Борзенка – Мороз [14], которая в 2010 году получила официальное разрешение к применению на территории Российской Федерации и является табельной для гипотермической консервации сквозных трансплантатов трупных донорских роговиц. Особенность среды Борзенка – Мороз в отличие от зарубежных аналогов (Optisol, Eusol) состоит в том, что авторами был подобран аминокислотный состав характерный для водянистой влаги глаза. Настоящая среда, предложенная нами, отличается от среды Борзенка – Мороз наличием в составе лекарственного средства «Фосфоглив», представляющего из себя группу физиологически активных фосфолипидов. Таким образом, в процессе консервации роговицы достигается восстановление липидного слоя мембран эндотелиальных клеток, способствующее повышению устойчивости к стрессовому воздействию, в том числе при механическом выкраивании ультратонкого трансплантата и, собственно, задней послойной трансплантации.

    

    Заключение

     В результате проведенных исследований доказано, что модифицированная среда для консервации заднего послойного трансплантата донорской роговицы [5] не только способствует оптимальной дегидратации стромы роговицы, что было показано в ранее проведенном исследовании [6], но также является нетоксичной. Среда обеспечивает жизнеспособность и функциональность эндотелия роговицы как минимум до 7 дней консервации. Она сохраняет уникальный фенотип кератоцитов, оказывая незначительное влияние на их пролиферативную активность. Исследования показали перспективность и целесообразность дальнейших шагов по внедрению новой среды в практику работы глазных банков с её дальнейшей клинической оценкой.

    

    Вклад авторов в работу:

    

    С.А. Борзенок: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    Б.Э. Малюгин: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    Д.С. Островский: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, написание текста.

    А.К. Ахмедов: сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.

    Х.Д. Тонаева: сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.

    Ю.А. Комах: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование.

    М.Х. Хубецова: сбор, анализ и обработка материала, написание текста.

    

    Author’s contribution:

    S.A. Borzenok: substantial contribution to concept and design of the work, editing, final approval of the version to be published.

    B.E. Malyugin: substantial contribution to concept and design work, editing, final approval of the version to be published.

    D.S. Ostrovskiy: a significant contribution to the conception and design of the work, acquisition, analysis and processing of the material, writing the text.

    A.K. Ahmedov: collection, analysis and processing, statistical processing of data, writing the text.

    H.D. Toneva: collection, analysis and processing, statistical processing of data, writing of the text.

    Yu.A. Komakh: substantial contribution to conception and design work, editing.

    M.H. Khubetsova: collection, analysis and processing of the material, writing the text.

    

    Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.

    Авторство: Все авторы подтверждают, что они соответствуют действующим критериям авторства ICMJE.

    Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    ORCID ID: Островский Д.С. 0000-0002-2817-7102

    

    Funding: The authors have not declared a specific grant for this research from any funding agency in the public, commercial or not-for-profit sectors.

    Authorship: All authors confirm that they meet the current ICMJE authorship criteria.

    Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.

    Conflict of interest: Тhere is no conflict of interest.

    ORCID ID: Ostrovskiy D.S. 0000-0002-2817-7102


Страница источника: 32-39

OAI-PMH ID: oai:eyepress.ru:article45574
Просмотров: 11339


Офтальмохирургия

Офтальмохирургия

Новое в офтальмологии

Новое в офтальмологии

Мир офтальмологии

Мир офтальмологии

Российская офтальмология онлайн

Российская офтальмология онлайн

Российская детская офтальмология

Российская детская офтальмология

Современные технологии в офтальмологии

Современные технологии в офтальмологии

Точка зрения. Восток - Запад

Точка зрения. Восток - Запад

Новости глаукомы

Новости глаукомы

Отражение

Отражение

Клинические случаи в офтальмологии

Клинические случаи в офтальмологии
Bausch + Lomb
Reper
NorthStar
ЭТП
Rayner
Senju
Фармстандарт
Гельтек
santen
Акрихин
Ziemer
Tradomed
Екатеринбургский центр Микрохирургия глаза
МТ Техника
Nanoptika
R-optics
Фокус
sentiss
nidek
aseptica