Рис. 1. Морфологическая картина клеточной культуры кератоцитов: а) 3 сутки, контрольная группа; б) – 3 сутки, экспериментальная группа; в) – 14 сутки, контрольная группа; г) – 14 сутки, экспериментальная группа Световая фазово-контрастная микроскопия, ув. 100х. Fig. 1. Morphological picture of the cell culture of keratocytes: а) 3rd day, the control group; б) 3rd day, the experimental group; d) 14th days, control group; г) 14th day, the experimental group. Light phase contrast microscopy, magnification – 100x
Рис. 2. Иммуноцитохимическая картина культуры кератоцитов: а), б) – экспрессия Кератокана (красный цвет) и Люмикана (зеленый цвет) в), г) – экспрессия α-гладкомышечного актина (зеленый цвет); а), в) – контрольная группа, б), г) – экспериментальная группа. Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра контрастированы бис-бензимид (Hoechst 33258), ув. 100х
Fig. 2. Immunocytochemical picture of the culture of keratocytes: а), в) – expression of Keratocan (red color) and Lumikan (green color); в), г) – expression of α-smooth muscle actin (green color); а), в) – control group, б), г) – experimental group. Immunocytochemical staining, laser scanning confocal microscopy, nuclei contrasted with bis-benzimide (Hoechst 33258), magnification – 100x
Известен факт посмертной гипергидратации донорских роговиц, находящихся в стандартных консервационных средах, что не позволяет получать оптимальную толщину трансплантата с использованием техники одинарного прохода микрокератома. Однако до настоящего времени как в России, так и за рубежом отсутствуют консервационные среды, обеспечивающие оптимальную степень содержания влаги в донорской роговице. В связи с этим нами разработана оригинальная рецептура среды, служащая для дегидратации донорских роговиц на этапе консервации [5]. В ранее проведенных исследованиях установлен факт более оптимальной гидратации трупной донорской роговицы, хранившейся в предложенной среде [6]. Однако вопросы переживаемости кератоцитов и клеток заднего эпителия роговицы, консервированной в данной среде, ранее не изучались.
Цель
Сравнить переживаемость кератоцитов и клеток заднего эпителия (эндотелия) донорской роговицы человека в усовершенствованной среде для её оптимальной гидратации перед выкраиванием ультратонкого заднего послойного трансплантата методом одинарного прохода микрокератома.
Материал и методы
Получение клеточных культур 2D культура кератоцитов
Рис. 3. Иммуноцитохимическая картина культуры кератоцитов: а), б) – экспрессия цитохрома С (красный цвет) и BAX (зеленый цвет) в), г) – экспрессия Каспазы 8 (зеленый цвет) и Каспазы 3 (красный цвет); а), в) – контрольная группа, б), г) – экспериментальная группа. Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра контрастированы бис-бензимид (Hoechst 33258), ув. 100х Fig. 3. Immunocytochemical picture of the culture of keratocytes: а), б) – expression of cytochrome C (red color) and BAX (green color); в), г) – expression of Caspase 8 (green color) and Caspase 3 (carse color); а), в) – control group, б), г) – experimental group. Immunocytochemical staining, laser scanning confocal microscopy, nuclei contrasted with bis-benzimide (Hoechst 33258), magnification – 100x
Рис. 4. Иммуноцитохимическая картина клеток эндотелия роговицы: экспрессия Na/K АТФазы (красный цвет), ZO – 1 (зеленый цвет); а) – контрольная группа, б) – экспериментальная группа. Иммуноцитохимическое окрашивание, лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, ядра контрастированы бис-бензимид (Hoechst 33258), ув. 100х Fig. 4. Immunocytochemical picture of corneal endothelial cells: Na / K ATPase expression (red color), ZO – 1 (green color); а) – control group, б) – experimental group. Immunocytochemical staining, laser scanning confocal microscopy, nuclei contrasted with bis-benzimide (Hoechst 33258), magnification – 100x
Культивирование кератоцитов проводили в двух опытных группах: контрольная группа – культивирование в стандартной культуральной бессывороточной среде (DMEM/F12 (Sigma Aldrich, США), Фактор роста фибробластов – 10 нг/мл (ПанЭко, Россия), эпителиальный фактор роста – 5 нг/мл (ПанЭко, Россия), L-аскорбиновая кислота – 10 нг/мл (Sigma aldrich, США), 1% раствор антибиотиков (Thermofisher scientific, США), L-глутамин – 2 мМ (Thermofisher scientific, США)). В экспериментальной группе использовали оригинальную среду для консервации заднего послойного трансплантата донорской роговицы [5]. Для изучения воздействия на кератоциты использовали 2D клеточную культуру 3 пассажа. Посевная концентрация кератоцитов составила 4,2*104 клеток в 1 мл, культивирование проводили в чашках Петри 60 мм (SPL, Южная Корея), при стандартных условиях (37 0С, 5% СО2), срок культивирования – 14 дней, смена среды каждые 3-е суток.
Эндотелий роговицы
Для изучения переживания эндотелия роговицы в культуральных растворах использовали 5 пар корнеосклеральных дисков из Глазного тканевого банка ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Фёдорова» Минздрава России. Средний возраст доноров составил 43±7 года, время от момента смерти до начала эксперимента не превышало 18 часов.
Полученные корнеосклеральные диски очищали от переднего эпителия, используя офтальмологический скарификатор. Далее диски переносили в культуральные флаконы, с добавлением 15 мл питательной среды: контрольная группа – DMEM/F12 (Sigma aldrich, США), фетальная бычья сыворотка – 2% (Thermofisher scientific, США), раствор антибиотиков - 1% (Thermofisher scientific, США), L-глутамин – 2 мМ (Thermofisher scientific, США); экспериментальная группа – оригинальная среда. Культивирование проводили при стандартных условиях (37 0С, 5% СО2), срок культивирования составил 7 дней, смена среды каждые 3-е суток.
Иммуноцитологическое исследование клеточных культур
Для подтверждения клеточного фенотипа кератоцитов и эндотелия роговицы проводили иммуноцитохимический анализ: для кератоцитов изучали специфические маркеры – Кератокан (sc-66941; Santa Cruz, США), Люмикан (ab-168348; Abcam, Великобритания), для эндотелия роговицы – ZO-1 (ab-221546; Abcam, Великобритания) и Na/K АТФазу (sc-48345; Santa Cruz, США). Кроме того, оценивали экспрессию α-гладкомышечного актина (ab-7817; Abcam, Великобритания), данный маркер является неспецифичным для кератоцитов, но его обнаружение в культуре свидетельствует о переходе кератоцитов в миофибробласты. Также в 2D культуре кератоцитов оценивали апоптоз: для определения активации каспазного пути апоптоза изучали Каспазы 3 (ab-44976; Abcam, Великобритания) и 8 (ab-32397; Abcam, Великобритания), для активации митохондриального пути апоптоза изучали Цитохром С (ab-110325; Abcam, Великобритания) и BAX (ab-81083; Abcam, Великобритания).
Спустя 14 суток культивирования кератоцитов и 7 суток культивирования корнеосклеральных дисков проводили их фиксацию в 10% нейтральном формалине (pH=7,0) в течение 15 мин при комнатной температуре, после чего трехкратно отмывали в растворе PBS (ПанЭко, Россия). Далее 2D культуру кератоцитов и корнеосклеральные диски обрабатывали 0,25 % раствором Triton X-100 (Thermofisher scientific, США) в течение 20 минут при комнатной температуре, с последующим трехкратным промыванием PBS. Инкубирование с первичными антителами проводили в течение 60 мин в темноте при комнатной температуре с последующим трехкратным промыванием PBS. Затем проводили инкубирование с вторичными антителами Alexa Fluor 488 (ab150113; Abcam, Великобритания) и Alexa Fluor 594 (ab 150080; Abcam, Великобритания) в течение 60 мин в темноте при комнатной температуре. Ядра клеток контрастировали Hoechst 33258 (ab 228550; Abcam, Великобритания) в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре. Изучение образцов проводили на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Olympus Fluoview FV 10i (Olympus, Япония).
Изучение жизнеспособности клеток
Жизнеспособность кератоцитов оценивали на проточном цитофлуориметре «CytoFlex» (Beckman Coulter, США) используя флуоресцентный краситель «Live and Dead» (ab 115347; Abcam, Великобритания) по протоколу, заявленному производителем. Определение индекса пролиферации проводили в автоматическом счетчике клеток «Luna II» (Logos Biosystems, Южная Корея) по стандартному протоколу.
Для определения жизнеспособности эндотелиальных клеток роговицы так же использовали флуоресцентный краситель «Live and Dead», с последующим изучением препаратов на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе «Olympus Fluoview FV 10i» (Olympus, Япония).
Морфологическая оценка эндотелия роговицы
Рис. 5. Морфологическая картина клеток эндотелия роговицы на 7-е сутки культивирования: а) – контрольная группа, б) – экспериментальная группа; Электронная сканирующая микроскопия, высокий вакуум, ускоряющее напряжение 15 kV, ув. 1000х Fig. 5. Morphological picture of corneal endothelial cells on the 7th day of cultivation: а) – control group, б) – experimental group. Scanning electron microscopy, high vacuum, accelerating voltage 15 kV. Magnification – 1000x
Таблица 1. Динамика изменения количества кератоцитов по группам, тыс. клеток Table 1. The dynamic changes of the keratocyte numbers in groups, thousand cells
Статистический анализ
Статистическую обработку полученных данных проводили, используя методы описательной статистики с помощью программного обеспечения «Graph Pad Software Prisma 7».
Результаты
Качественная оценка роста и фенотипа 2D культуры кератоцитов
Морфология кератоцитов в исследуемых группах была представлена схожими биполярными мезенхимоподобными клетками (рис. 1).
При оценке пролиферации отметили слабую пролиферативную активность кератоцитов в обеих исследуемых группах в течение всего срока культивирования. Коэффициент пролиферации в экспериментальной группе составил 12,63%, в контрольной группе – 13,86%. Количество делящихся кератоцитов в обеих группах в разные сроки культивирования представлены в таблице 1. При сравнительном анализе кривой изменения количества клеток статистической разницы между группами выявлено не было, что может свидетельствовать об отсутствии у исследуемых составов сред стимуляции к пролиферации.
При изучении жизнеспособности кератоцитов в течение всего срока культивирования, с использованием флуоресцентного красителя «Live and Dead», было выявлено отсутствие статистической разницы между группами (табл. 2).
Иммуноцитохимическое окрашивание показало, что кератоциты активно экспрессируют Кератокан и Люмикан и не экспрессируют специфический маркер миофибробластов – α-гладкомышечный актин (рис. 2).
В обеих группах выявили отсутствие экспрессии маркеров раннего апоптоза каспазного пути (Каспазы 3 и 8), а также митохондриального пути – Цитохрома С и BAX (рис. 3).
Полученные результаты показали, что новое средство для консервации заднего послойного трансплантата донорской роговицы является нетоксичным и способствует сохранению уникального фенотипа кератоцитов.
Качественная оценка роста и фенотипа эндотелия роговицы
В обеих исследуемых группах спустя 7 дней культивирования отмечали потерю плотности клеток эндотелия, которая между группами была статистически недостоверной (табл. 3).
При детекции живых и мертвых клеток флуоресцентным красителем значительных различий между группами также выявлено не было (табл. 4). Следует отметить, что потеря клеток в обеих группах не превышала 8%.
Таблица 2. Соотношение живых / мертвых кератоцитов, % Table 2. The ratio of live / dead keratocytes, %
Таблица 3 Динамика изменения количества клеток эндотелия по группам, клеток на мм2 Table 3 Dynamics of changes in the number of endothelial cells by groups, cells per mm2
При анализе морфологии клеток эндотелия роговицы на 7-е сутки культивирования с использованием электронной сканирующей микроскопии выявили клетки характерной гексагональной формы, а также группы клеток, утративших целостность клеточной мембраны и с ярко выраженным клеточным ядром, свидетельствующим об их нежизнеспособности (рис. 5).
Полученные результаты показали, что разработанная среда для консервации заднего послойного трансплантата донорской роговицы способствует сохранению жизнеспособного и функционального эндотелия роговицы как минимум до 7 дней культивирования.
Обсуждение
В настоящее время ведется множество работ, направленных на получение ультратонкого трансплантата для задней послойной кератопластики, поскольку доказано, что минимизация количества остаточной стромы на трансплантате способствует значительному повышению зрительных функций в послеоперационном периоде [7, 8].
На сегодня существует несколько методик получения ультратонкого трансплантата задних слоев роговицы, включающих в себя технику двойного реза микрокератомом, использование лазера, а также методику предварительной дегидратации донорской роговицы путем ее помещения в специальные среды.
Применение техники двойного реза микрокератома способствует получению более равномерного трансплантата толщиной около 100 мкм [9]. Однако данная методика имеет высокий риск перфорации донорской роговицы. Кроме того, в проведенных исследованиях было показано, что отношение нежизнеспособных клеток эндотелия донорской роговицы к общему количеству эндотелиальных клеток в группе двойного реза составило 0,0145, а в группе с одним резом – 0,0028. Таким образом, проведение дополнительного реза донорской роговицы приводит к статистически значимому более высокому количеству поврежденных нежизнеспособных эндотелиальных клеток [10].
Применение лазеров (преимущественно фемтосекундных) для выкраивания трансплантата задних слоев роговицы приобретает все большую популярность ввиду простоты методики и возможности получения равномерного трансплантата заданной толщины. Однако данная методика характеризуется более высокой потерей эндотелиальных клеток по сравнению с применением микрокератома [11]. Стоит отметить, что применение фемтосекундного лазера сопровождается вторичным индуцированным УФ-излучением, приводящему к излишнему накоплению перекисных радикалов в тканях. Эти радикалы оказывают повреждающее действие на клеточные (кератоциты, эндотелиоциты) и тканевые структуры стромы роговицы, что может провоцировать избыточную асептическую воспалительную регенеративную реакцию [12]
Другим направлением получения ультратонких трансплантатов является предварительная дегидратация донорской роговицы непосредственно перед выкраиванием. Данная методика предполагает дополнительные манипуляции с переносом донорской роговицы в отдельную ёмкость со специальным раствором, что повышает риск контаминации донорского материала [13].
В настоящее время нет ни одной научной работы, в которой проводится изучение апоптоза, а также изучаются хромосомные повреждения в кератоцитах и эндотелии донорских роговиц, хранившихся в различных консервационных средах перед выкраиванием с помощью традиционных методов (механический кератом, фемтосекундный лазер). Такие исследования представляют несомненный научный и практический интерес.
Модифицированная среда для консервации заднего послойного трансплантата донорской роговицы [5] была сконструирована на основе ранее зарекомендовавшей себя среды Борзенка – Мороз [14], которая в 2010 году получила официальное разрешение к применению на территории Российской Федерации и является табельной для гипотермической консервации сквозных трансплантатов трупных донорских роговиц. Особенность среды Борзенка – Мороз в отличие от зарубежных аналогов (Optisol, Eusol) состоит в том, что авторами был подобран аминокислотный состав характерный для водянистой влаги глаза. Настоящая среда, предложенная нами, отличается от среды Борзенка – Мороз наличием в составе лекарственного средства «Фосфоглив», представляющего из себя группу физиологически активных фосфолипидов. Таким образом, в процессе консервации роговицы достигается восстановление липидного слоя мембран эндотелиальных клеток, способствующее повышению устойчивости к стрессовому воздействию, в том числе при механическом выкраивании ультратонкого трансплантата и, собственно, задней послойной трансплантации.
Заключение
В результате проведенных исследований доказано, что модифицированная среда для консервации заднего послойного трансплантата донорской роговицы [5] не только способствует оптимальной дегидратации стромы роговицы, что было показано в ранее проведенном исследовании [6], но также является нетоксичной. Среда обеспечивает жизнеспособность и функциональность эндотелия роговицы как минимум до 7 дней консервации. Она сохраняет уникальный фенотип кератоцитов, оказывая незначительное влияние на их пролиферативную активность. Исследования показали перспективность и целесообразность дальнейших шагов по внедрению новой среды в практику работы глазных банков с её дальнейшей клинической оценкой.
Вклад авторов в работу:
С.А. Борзенок: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
Б.Э. Малюгин: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.
Д.С. Островский: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, написание текста.
А.К. Ахмедов: сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.
Х.Д. Тонаева: сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.
Ю.А. Комах: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование.
М.Х. Хубецова: сбор, анализ и обработка материала, написание текста.
Author’s contribution:
S.A. Borzenok: substantial contribution to concept and design of the work, editing, final approval of the version to be published.
B.E. Malyugin: substantial contribution to concept and design work, editing, final approval of the version to be published.
D.S. Ostrovskiy: a significant contribution to the conception and design of the work, acquisition, analysis and processing of the material, writing the text.
A.K. Ahmedov: collection, analysis and processing, statistical processing of data, writing the text.
H.D. Toneva: collection, analysis and processing, statistical processing of data, writing of the text.
Yu.A. Komakh: substantial contribution to conception and design work, editing.
M.H. Khubetsova: collection, analysis and processing of the material, writing the text.
Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.
Авторство: Все авторы подтверждают, что они соответствуют действующим критериям авторства ICMJE.
Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.
Конфликт интересов: Отсутствует.
ORCID ID: Островский Д.С. 0000-0002-2817-7102
Funding: The authors have not declared a specific grant for this research from any funding agency in the public, commercial or not-for-profit sectors.
Authorship: All authors confirm that they meet the current ICMJE authorship criteria.
Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.
Conflict of interest: Тhere is no conflict of interest.
ORCID ID: Ostrovskiy D.S. 0000-0002-2817-7102
