Перспективы применения наночастиц Ag(10%):InP/ZnS MPA в лечении дрожжевых кератомикозов

    

    Актуальность

    Грибковые паразитические поражения глаза и его придаточного аппарата принято называть окуломикозами (лат. oculus – «глаз»; лат. mycoses; греч. mykes – «гриб»). При этом практически любая анатомическая область может быть вовлечена в инфекционный процесс и проявляться в виде микозов век, слезных органов, конъюнктивы, роговицы, сосудистой оболочки (грибковый увеит), а также эндофтальмита. Такая широкая вариабельность поражений напрямую коррелирует с фактом практически повсеместного распространения «царства Грибов» в живой природе и их обитании на поверхности человеческого тела как симбионтов и комменсалов с бактериальной популяцией [1].

    В свою очередь инфекционные поражения роговицы являются одной из ведущих причин слепоты и слабовидения, с частотой встречаемости до 800 случаев на 100 000 населения в год (0,8 %), при этом грибковые поражения и микстинфекции в структуре данных поражений занимают лидирующие позиции, обходя бактериальные, вирусные и паразитарные инвазии, по некоторым данным [2–4].

    Сложности ведения данной группы пациентов ассоциируются с рядом негативных факторов, а именно: склонностью грибковых поражений к более глубокому инфицированию роговичной ткани (поражение задних отделов стромы), трудностями лабораторной диагностики (сложность забора материала и длительный период роста и идентификации возбудителя), рецидивирующим характером течения инфекции (неконтролируемый захват тканей с тенденцией к вовлечению склеры, переходу к эндофтальмиту/ панофтальмиту). Более того, ситуацию отягощает ограниченный арсенал терапевтических средств и низкая эффективность хирургического лечения, что ведет к чрезвычайно низким анатомическим и функциональным результатам [5–9].

    Неоспоримым является факт регионального детерминизма и зависимости от климатических условий в структуре возбудителей грибковых кератитов [10]. Дрожжеподобные грибы рода Candida spp. чаще наблюдаются в регионах с умеренным климатом (62,3%), низкой вовлеченностью населения в сельскохозяйственные работы и высоким уровнем жизни населения; также предрасполагающими факторами считаются заболевания глазной поверхности (например, недостаточная секреция слезы, отсутствие смыкания век), наличие признаков поливариантной иммуносупрессии, предшествующие оперативные вмешательства, ношение мягких контактных линз. В свою очередь, мицелиальные грибы, особенно Fusarium spp. и Aspergillus spp., доминируют в регионах с тропическим климатом, высоким уровнем занятости населения в полевых работах, у лиц мужского пола, с эпизодами травматизации эпителия роговицы объектами растительного или животного происхождения [11–13]. Соответственно, акцент на дрожжеподобную микрофлору представляет особый интерес для офтальмологов РФ.

    Современный опыт применения различных препаратов для лечения грибковых кератитов показывает, что дозировки и способы введения не стандартизированы, разнородные группы средств не сертифицированы и в некоторых случаях обладают токсическим потенциалом, препараты демонстрируют низкую фунгицидную активность, в силу низкой проникающей способности в ткани глаза и высокой химиорезистентности возбудителей инфекции [14].

    Одним из альтернативных подходов к ведению грибковых кератитов может служить применение наночастиц – в монотерапии или в качестве катализатора – для более эффективного воздействия нативного лекарственного средства (н-р антибиотика/антимикотика). В качестве наночастиц выступают квантовые точки (КТ), которые представляют собой синтезированные химическим методом нанообъекты диаметром 2–10 нм, состоящие из групп полупроводников периодической системы химических элементов. Под действием света видимой области спектра КТ способны к участию в реакциях окисления-восстановления и моделируемому образованию активных форм кислорода (АФК) путем изменения электронных взаимодействий с атомами окружения, механизм данных взаимодействий подробно описан в работах [15–23]. За счет этих процессов возможно нарушение в работе всей электронно-транспортной цепи ин-фекционного агента с увеличением его чувствительно-сти к активному веществу. Более того, сверхмалые раз-меры КТ позволяют им с легкостью проникать в струк-туры объекта.

    Цель

    Синтез КТ, потенциально активных в отношении грибковой микрофлоры, изучение способности данного типа КТ и аналогов к выработке АФК и анализ их фунгицидной активности в отношении дрожжевой микрофлоры in vitro, которая играет одну из ключевых ролей в развитии инфекционного процесса в РФ по данным вышеописанной эпидимиологии.

    Материал и методы

    Синтез КТ

    Техническое задание для НИИ «Прикладная акустика» (научно-производственная база разработки КТ широкого диапазона) (г. Дубна) было сформировано на основании следующих характеристик: синтезируемые КТ прежде всего должны содержать не менее 1% серебра в своем составе, на основании рандомизированных исследований [24] для возможности потенциального фунгицидного эффекта; иметь размер не более 5 нм (2–3 оболочки) для обеспечения прохождения через клеточную мембрану возбудителя инфекции и обладать реактогенно-стью; в составе КТ не должны присутствовать полупро-водники, обладающие возможными токсическими свой-ствами во время полураспада молекулы [25]; в качестве растворителя должна использоваться вода, для потенциальной возможности эпибульбарного использования квантовый выход флуоресценции не должен превышать 0,5%, являясь индикатором образования АФК (квантовый выход, равный 1, стремится к образованию фотона в ответ на каждый поглощенный, что нивелирует участие свободных электронов на внешнем энергетическом уровне КТ в окислительно-восстановительных реакциях).

    Используемые реактивы для синтеза КТ: октадецен (Fluka, 90%), селен (Merck, 99%), теллур (Aldrich, 99,8%), олеиламин (90 %, Sigma), метанол (HPLC), триоктилфосфин (Sigma, 90%), ацетат цинка (Sigma, 99%), трис-(диэтиламино)фосфин (Aldrich, 97%), 3-меркаптопропионовая кислота (Enamine, 95%).

    Спектры поглощения образцов измеряли на спектрофотометре UV-Vis-NIR Cary 5000 (с шагом 1 нм). Спектры фотолюминесценции измеряли на спектрофлуориметре HORIBA Fluorolog-3. Синтез проводили в соответствии с методикой [26]. Солюбилизацию в водную фазу проводили с использованием 3-меркаптопропионовой кислоты. Модификацию и очистку образцов проводили по методике [27]. Полученные растворы экспортировались заказчику в условиях стерильности.

    Способность КТ к образованию АФК

    В качестве маркера формирования АФК, обладающего восстановительными свойствами, был использован цитохром С (CytC). Простота его использования и спектрометрический метод детекции восстановленной формы CytC был описан ранее E. Yaghini и соавт. [28]. Используемые материалы: КТ CdSe/ZnS-PEG, InP/ZnS-MPA, AgInP/ ZnS-MPA, (Acros, 99%), Натрия борогидрид, (Scharlau, 95%), Цитохром С, (CytC, ООО «Самсон-Мед»). Фотовосстановление CytC проводили в буфере PbS с рН 11,5 (при меньшем рН наблюдалось восстановление CytC в темноте в случае индиевых КТ). Предварительно готовили 2,5 мл дисперсии КТ CdSeZnS с концентрацией 80 нМ (0,12% масс). Образец помещали в кювету и записывали базовую линию. Далее, избегая прямого попадания света на образец, вносили CytC до концентрации 15 мкМ. Записывали спектр поглощения образца. Затем образец в кювете облучали светодиодной лампой 1 мин и снова записывали спектр. Операции повторяли до достижения общего времени облучения 5 мин. Аналогично исследовали дисперсии КТ AgInP/ZnS и InP/ZnS с концентрациями 0,03% и 0,042% масс соответственно, при этом фиксировались равные оптические плотности дисперсий для всех образцов на длине волны облучения (450 нм). Равные оптические плотности образцов на длине волны облучения подразумевают одинаковое количество поглощенных образцом фотонов в единицу времени. Степень восстановления CytC отслеживали по возникновению характерного пика на 550 нм. Рассчитывали относительное значение оптической плотности данного пика как А(пика)=А(550нм) – А(565нм), где оптическая плотность А на 565нм соответствует значению локального минимума восстановленной формы CytC. Строили зависимость А(пика) от времени облучения (рис. 4). Для корректного сравнения начальных скоростей фотореакции, начальные скорости восстановления, полученные в эксперименте, нормировали на молярный коэффициент экстинкции восстановленной формы CytC на 550 нм (28000 1/см×М).

    Исследование антиинфекционных свойств in vitro

    На базе ГАУЗ СО «Клинико-диагностический центр» (г. Екатеринбург) из клинического материала было выделено 9 изолятов идентифицированных как грибы рода Candida, в т.ч. C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis. C.albicans доминировала по численности. Вся совокупность микобиоты проявляла свойства множественной устойчивости к фунгицидным препаратам, в частности к Амфотерицину-Б(табл. 2). Для эксперимента использовали плотную питательную среду Мюллер-Хинтона, содержащую 2% глюкозу. Для приготовления инокулюма использовали суточные культуры исследуемых Candida spp. Мутность инокулюма соответствовала 0,5 McFarland (1х106 – 5х106 клеток/мл). Посев инокулюма проводили не позднее, чем через 15 мин с момента его приготовления. Стерильный хлопковый тампон погружали в инокулюм, затем избыток инокулюма удаляли, отжав тампон о стенки пробирки. Инокуляцию в чашку Петри, со средой Мюллер-Хинтона с глюкозой, проводили штриховыми движениями в трех направлениях, поворачивая чашку Петри на 60°. Не позднее чем через 15 мин после инокуляции на поверхность питательной среды наносили 2 точки растворов: нативный раствор КТ (10%) и разведенные КТ 1:100 (0,1%) дистиллированной водой, объёмом 0,5 мкл. Инкубировали при температуре 35±20С 18–24 часа. После окончания инкубации чашки помещали кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста (ЗЗР) измеряли с точностью до 1 мм. При измерении зон задержки роста ориентировались на зону полного подавления видимого роста. В качестве источника возбуждения использовался свет видимой области спектра.

    Статистическая обработка данных

    Параметрические критерии различий рассчитывались путем сравнения величин выборочных дисперсий рядов наблюдений (выборок) объема n1 по F-критерию Фишера (FЭМП) по формуле:

    Сравниваемые выборки распределены по нормальному закону.

    Результаты

    Результаты синтеза КТ

    Паспортные данные, технические и спектральные характеристики синтезированных КТ представлены на рисунках 1–3.

    Из представленных данных видно, что КТ в соответствии с техническим заданием представляют собой 10% водную дисперсию с квантовым выходом 0,1%, определяющим потенциальную способность к выработке АФК. КТ содержат в своем составе биологически инертные полупроводники, имеют широкий спектр поглощения, который определяет их активность в видимой области спектра. Спектр флуоресценции в свою очередь смещен в инфракрасную область, минимизируя возбуждение фоторецепторов. Поверхность КТ функционализирована 3-меркаптопропионовой кислотой, для повышения их физической стабильности при взаимодействии с биологическим окружением.

    Исходя из данных [34] разработанные КТ могут конкурировать с современными аналогами в данной области исследований.

    Результаты исследования выработки АФК

    На рисунке 4 показано, что наибольшими скоростями генерации всех АФК отличаются КТ InP/ZnS. Предположительно данный результат связан с фотофизическими свойствами ядра InP, которое при достаточной пассивации (были использованы InP/ZnS c относительно толстой ZnS оболочкой, более 3нм) сульфидом цинка, обладает наилучшим разделением заряда в возбужденном состоянии КТ и его передаче во внешнюю среду. КТ AgInPZnS в целом обладают на 92% тем же составом ядра, что и InP/ZnS, но существенно меньшей толщиной оболочки ZnS. Видимо, поэтому в данном случае вероятность реакций c образованием АФК всех типов с их поверхностью крайне высока. По факту, при непродолжительном облучении они буквально растворяются (крайне низкая фотостабильность). Это, очевидно, приводит к снижению видимой скорости генерации АФК относительно недопированных InP/ZnS с толстой защитной оболочкой. В этом свете поведение кадмиевых КТ логично вписывается в предложенную теорию. Именно в этом случае окисление материала полупроводника затруднено (CdSe/ZnS наиболее фотостабильные КТ), что дает высокую генерацию АФК.

    Результаты исследования антиинфекционных свойств in vitro

    В ходе исследования удалось выявить полное подавление видимого роста грибов рода Candida spp. в зоне обработанной КТ, вне зависимости от их концентрации. Диаметр ЗЗР во всех случаях превышал 24 мм, что соответствовало высокой степени чувствительности (табл. 1, рис. 5–6).

    Результаты статистической обработки данных

    Во всех случаях исследуемые величины попали в зону значимости (Fэпм = 5,38±1,32), что соответствует по оси значимости значениям P ≤0,01 (табл. 1, 2).

    Обсуждение

    Полученные результаты позволяют предположить перспективность эпибульбарного использования нативного раствора КТ в разведении в качестве средств лечения резистентных грибковых кератомикозов, после проведения исследований по острой и хронической цитотоксичности. Рассматривается комбинированный механизм воздействия на патогенную флору: запуск процессов опосредованного АФК окисления во внутриклеточных кластерах, с нарушением окислительно-восстановительных процессов внутри органелл гриба, и непо-средственное фунгицидное действие молекул серебра, теоретическое обоснование которых описано в [29–33] и заключается в изменении электростатических взаимодействий в клетке возбудителя, нарушении работы клеточной стенки, а также в нарушении работы транспортных белков, переносящих питательные вещества из вне- во внутриклеточное пространство.

    Также необходимо исследовать вопросы комбинированного воздействия растворов КТ в различных концентрациях в сочетании с известными эпибульбарными антимикотиками, для развития аддитивного эффекта (последовательная или конъюгатная терапия), после исследования вопросов физического и химического взаимодействия анализируемых химических субстратов.

    Заключение

    Синтезированные КТ Ag(10%):InP/ZnS MPA показали высокую антиинфекционную активность в отношении резистентной дрожжевой микробиоты Candida spp. в лабораторных условиях, играющих одну из первостепенных ролей в течении кератомикозов.

    Доказана способность данного типа КТ и аналогов к выработке АФК, при этом наибольшей способностью к выработке АФК обладают КТ типа InP/ZnS.

    

    

    Информация об авторах

    Вячеслав Олегович Пономарев, к.м.н., офтальмохирург, ponomarev-mntk@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-2353-9610

    Виктор Николаевич Казайкин, д.м.н., врач-офтальмохирург, victor-ru66@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9569-5906

    Сергей Валерьевич Дежуров, врач-офтальмолог, dezh@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-4002-2197

    Софья Марковна Розанова, к.б.н., доцент, rsm@kdc-lab.ru

    Марина Валерьевна Кырф, врач-бактериолог, flame.teddy@gmail.com

    Владимир Леонидович Тимофеев, врач-офтальмохирург, vltimof92@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-7372-3870

    Information about the authors

    Vyacheslav O. Ponomarev, PhD in Medicine, ophthalmic surgeon, ponomarevmntk@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-2353-9610

    Viktor N. Kazajkin, Doctor of Sciences in Medicine, ophthalmic surgeon, victorru66@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-9569-5906

    Sergey V. Dezhurov, ophthalmologist, dezh@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-4002-2197

    Sofiya M. Rozanova, PhD in Biology, Associate Professor, rsm@kdc-lab.ru

    Marina V. Kyrf, doctor-bacteriologist, flame.teddy@gmail.com

    Vladimir O. Timofeev, ophthalmic surgeon, vltimof92@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-7372-3870

    Вклад авторов в работу:

    В.О. Пономарев: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    В.Н. Казайкин: сбор, анализ и обработка материала, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    С.В. Дежуров: сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.

    С.Ф. Розанова: сбор, анализ и обработка материала.

    М.В. Кырф: сбор, анализ и обработка материала, написание текста.

    В.О. Тимофеев: сбор, анализ и обработка материала, редактирование.

    Authors'contribution:

    V.O. Ponomarev: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of material, statistical data processing, writing, final approval of the version to be published.

    V.N. Kazaikin: collection, analysis and processing of material, editing, final approval of the version to be published.

    S.V. Dezhurov: collection, analysis and processing of material, statistical data processing, writing.

    S.M. Rozanova: collection, analysis and processing of material.

    M.V. Kyrf: collection, analysis and processing of material, writing.

    V.L. Timofeev: collection, analysis and processing of material, editing.

    Финансирование: Авторы не получали конкретный грант на это исследование от какого-либо финансирующего агентства в государственном, коммерческом и некоммерческом секторах.

    Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Funding: The authors have not declared a specific grant for this research from any funding agency in the public, commercial or not-for-profit sectors.

    Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.

    Conflict of interest: Тhere is no conflict of interest.

    Поступила: 22.08.2022

    Переработана: 12.09.2022

    Принята к печати: 19.10.2022

    Originally received: 22.08.2022

    Final revision: 12.09.2022

    Accepted: 19.10.2022