Рис. 1. Среднее спектральное пропускание на длинах волн от 380 до 780 Нм Примечание: 1 – контрольная группа , 2 – группа NaCl− ,3 – группа NaCl+
Рис. 2. Графики сравнения прозрачности 1-й (контрольной) и 2-й группы (NaCl+)
Кроме того, наличие клеток в свежей ткани роговицы потенциально повышает риск иммунного отторжения лентикулы при трансплантации. Для решения этой задачи технологии тканевой инженерии, а именно методы децеллюляризации, позволяют создавать тканеинженерные конструкции роговицы (ТК). Целью данной методики является максимальное удаление клеток для снижения антигенной нагрузки при минимальном воздействии на структуру внеклеточного матрикса (ВКМ) [9-11]. Проблема хранения ТК является актуальной и общеизвестно, что после децеллюляризации лентикула набухает за счет отека коллагеновых волокон, что является критичным моментом, поскольку наличие жидкости в тканях при заморозке может привести к образованию кристаллов льда и разрушению клеток. Это приведет к нарушению прозрачности после размораживания тканей. На данный момент в литературе еще не было описано хранение ТК в диметилсульфоксиде (DMSO). В нашей работе мы попытались понять в рамках оценки прозрачности, существует ли связь между отечной и обезвоженной ТК после хранения в диметилсульфоксиде (DMSO). Для дегидратации ТК был использован разрешенный к клиническому применению в офтальмологии дисперсный вискоэластик (ДВ), содержащий 3,0% гиалуронат натрия и 4,0%-й хондроитин сульфат, массой 600.000 Дальтон.
Цель
Сравнение прозрачности дегидратированных и недегидратированных тканеинженерных конструкций роговицы после криоконсервирования.
Материал и методы
Рис. 3. Графики сравнения прозрачности 1-й (контрольной) и 2-й группы (NaCl–)
Рис. 4. Графики сравнения прозрачности 1-й (NaCl–) и 2-й (NaCl+) групп
Спектральное пропускание лентикулы определяли с помощью спектрофотометра Multiskan GO (Thermo Scientific, США) с длиной волны света от 380 до 780 нм, с шагом 10 нм. Данные спектрофотометра оценивались в 2 этапа. На 1-м этапе измеряли нативные лентикулы – контрольная группа (n=30). На втором этапе исследовали прозрачность двух опытных групп после хранения. Важно заметить, что после децеллюляризации и перед хранением одну часть образцов дегидратировали в ДВ в течение 1 часа (n=15), а другую часть не обезвоживали в ДВ (n=15). В связи с этим были сформированы две опытные группы: одна без добавления ДВ (NaCl− ), а другая с добавлением ДВ (NaCl+).
Протокол хранения. Образцы групп для NaCl– и NaCl+ переносили в криопробирки, содержащие 1 мл 80%-й тканевой культуральной среды (среда Борзенок-Мороз) и 20%-й DMSO (Applichem,США). Далее криопробирки (Corning, США) помещали в контейнер coolcell (Corning, США) и переносили в низкотемпературный морозильник на 1 сутки, после чего контейнер переносили в сосуд Дьюаре с жидким азотом с постоянной температурой –196°С. Далее через два дня образцы сначала размораживали на водяной бане, потом отмывали трижды в PBS. С целью снятия отека образцы обезвоживали в ДВ 1 час, затем их переносили в лунки 96-луночного планшета для измерения коэффициента пропускания (%). В качестве расчетного значения для статистического анализа данных использовали среднее для всей группы по 41 точке прозрачности полученного спектра.
В качестве описательных статистик переменных использовали среднее со стандартным отклонением (М±SD) и медиану с межквартильным размахом (Me (1-3 квартили). Нормальность распределения переменных оценивалась с использованием теста Шапиро-Уилка. Гомогенность дисперсий оценивалась с помощью теста Бартлетта. Для сравнения прозрачности лентикул в рамках одного протокола обработки был использован критерий Уилкоксона для двух зависимых групп и T-критерий Стьюдента для парных и зависимых выборок: сравнивались связанные выборки в двух разных точках, например, контроль-протокол. Для сравнения независимых выборок был использован U-критерий Манна-Уитни, например, протокол-протокол. При оценке результатов статистически значимыми считали результаты при значениях р<0,05. Данные визуализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8.4.3. Анализ полученных данных проводили с использованием среды для статистических вычислений R версии 4.0.2. (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия).
Результаты
Полученные данные представлены на рисунках 1-4. В частности, как видно из рисунка 1, прозрачность в группе NaCl+ незначительно снижена по сравнению с контролем, тогда как наиболее приближен к контролю протокол с использованием NaCl−.
Проведенный анализ выявил статистически значимые различия (рис. 2) в группах контроль – NaCl+: 90,83±0,95 против 86,47±4,07; (90,77 (90,10-91,60) против 88,01 (85,92-89,13); p<0,0001). На рис. 3 и 4 показано отсутствие статистически значимых различий, как в группах контроль – NaCl–: 86,87±5,40 против 87,57±3,51; (86,17 (82,05-91,75) 89,35 против (85,17-89,90); p≥0,596), так и в группах NaCl− - NaCl+ : 87,57±3,51 против 86,47±4,07; (89,35 (85,17-89,90) против (88,01 (85,92-89,13); p≥0,345) соответственно.
Таким образом, полученные представленные выше данные свидетельствуют, что, во-первых, предварительная дегидратация в ДВ, полученной ТК может незначительно уменьшить ее прозрачность в сравнении с контролем, и во-вторых, по-видимому, DMSO как мембранопроникающий криопротектор не приводит к значительному повреждению коллагеновой ультраструктуры внеклеточного матрикса ТК за счет препятствования образования кристаллов льда на внутриклеточном уровне.
Заключение
На основании нашего исследования мы считаем, что в целом группы NaCl– и NaCl+ незначительно теряют свою прозрачность после размораживания в сравнении с контролем. Обе группы могут рассматриваться как взаимозаменяемые.
