
Рис. 1. Кривые Каплана – Мейера «полного» (1-я группа) и «квалифицированного» (2-я группа) гипотензивного успеха
Fig. 1 Kaplan – Meier curves of complete (group 1) and qualified (group 2) hypotensive success

Рис. 2. Динамика интерлейкина 8 до, на 3-и сутки и через 2 мес. после операции в группах с полным (а) и квалифицированным (б) гипотензивным успехом (описание в тексте)
Fig. 2. Dynamics of interleukin 8 before, on the 3rd day and in 2 months after the surgery in groups with «complete» (a) and «qualified» (б) hypotensive success (description in the text)
Соглашаясь с тем, что раневой процесс после ФАВ является достаточно изученным, мы должны отметить, что «инструменты» для оптимизации формирования путей оттока внутриглазной жидкости (ВГЖ) еще далеки от совершенства. Против многих потенциальных мишеней найдены таргетные агенты: ингибирование трансформирующего фактора роста (TGF-β) происходит под влиянием рекомбинантных человеческих моноклональных антител (САТ-152), сурамина, траниласта; фармакологическое ингибирование каскада Rho-ROCK in vitro с помощью вещества Y-27632 подавляет ангиогенную активность эндотелиальных клеток; генная терапия и β-радиация предложены в качестве альтернативы фармакологическим агентам и т.д. [3–5]. Тем не менее данные относительно возможностей их использования для профилактики и лечения рубцевания обрывочны, описаны лишь в эксперименте или оказались недостаточно эффективными для широкого клинического применения [3–6].
Не вызывает сомнения, что различные пулы клеток, цитокинов, ростовых факторов и протеаз принимают участие в ходе регенераторно-репаративного процесса после ФАВ [7–9]. На всех этапах адекватность ранозаживления гуморально регулируется системой первичных и вторичных медиаторов посредством прямых межклеточных контактов, путем аутокринного и паракринного взаимодействия и т.д. [4, 7–9]. Однако какие из медиаторов являются манифестными, до конца не определено и требует дальнейшего уточнения. Цитокины (ЦК), являющиеся белками межклеточного взаимодействия, участвуют в развитии и регуляции локальных и (или) генерализованных реакций в ответ на нарушение целостности тканей, в том числе в ходе хирургических вмешательств. В зависимости от наделенных свойств, они индуцируют, ограничивают или, наоборот, пролонгируют воспаление, стимулируют рост, пролиферацию и дифференцировку клеток. Наряду с другими нейрогуморальными факторами, они регулируют развитие «каскада» местных реакций с участием различных типов клеток и тканей. Однако в настоящее время отсутствуют четкие представления о видовом и количественном составе ЦК, их динамике и степени влияния на трансформацию фаз процесса заживления. Следовательно, оценка их роли для дальнейшего понимания молекулярных основ процесса ранозаживления и его оптимизации после ФАВ не вызывает сомнения и продолжает оставаться актуальной.
Цель
Определить концентрацию провоспалительных и проангиогенных ЦК слезной жидкости у пациентов с ПОУГ до и после трабекулэктомии.
Материал и методы
Проведено проспективное клиническое исследование. Пациенты (n=83) с ПОУГ I–III стадии в возрасте 56,62±12,23 года с декомпенсированным ВГД на максимальной медикаментозной терапии (ММТ) прошли полное офтальмологическое обследование (визометрия, биомикроофтальмоскопия, компьютерная периметрия и др.). В предоперационном периоде корригированная острота зрения составила 0,63±0,25, уровень ВГД (Рt) – 29,3±4,7 мм рт.ст.; количество антиглаукомных препаратов – 2,3±0,9; длительность медикаментозного режима – 2,6±1,3 года. Критериями исключения явились предшествующие лазерные или хирургические вмешательства, заболевания глазной поверхности и придаточного аппарата глаза.
Трабекулэктомия была стартовой хирургической процедурой. Во всех случаях выполняли лимбальный доступ длиной 5 мм. Поверхностный склеральный лоскут выкраивали размером 3х3 мм, не менее ½ толщины склеры. Трабекулэктомию выполняли панчем (Kelly Membrane Descemet Punch 0,75 мм) с последующим формированием базальной колобомы радужки. Склеральный лоскут укрепляли в склеральном ложе 4–5 погружными швами нитью нейлон 10.0. Фильтрационную подушку (ФП) формировали узловыми корнео-склеро-конъюнктивальными погружными швами нитью нейлон 10.0. Субконъюнктивально в область ФП вводили 0,1 мл раствора (в разведении 5-фторурацил (5-ФУ) 0,1 мл и дексазон 0,3 мл) в 7–8 мм дистальнее лимба. В послеоперационном периоде все пациенты получали пролонгированную противовоспалительную схему: антибиотик широкого спектра действия 1 капля 3 раза в день (р/д) 7–10 дней; глюкокортикоид (ГК) дексаметозон 0,1% раствор в течение 2 мес. по убывающей схеме (2 нед. – 1 капля 5 р/д; 2 нед. – 1 капля 4 р/д, 2 нед. – 1 капля 3 р/д, 2 нед. – 1 капля 2 р/д), нестероидное противовоспалительное средство (НПВС) в течение 1 мес. В случае развития симптоматики неадекватной воспалительной реакции, по данным биомикроскопии или УБМ-мониторинга, проводили лазерную сутуротомию, нидлинг, дополнительно назначали транспальпебральный массаж, местные антигистаминовые или иммуномодулирующие агенты.
Состоятельность вновь сформированных путей оттока ВГЖ оценивали методом ультразвуковой биомикроскопии (УБМ) на приборе Aviso (French) по разработанной в Иркутском филиале ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» УБМ-классификации [10]. Проводили количественную (измерение высоты интрасклерального канала (ИСК) в мм; высоты скана, включающего все три отдела (внутренняя фистула, ИСК и ФП, в мм) и качественную (степень эхогенности, баллы) оценку состояния путей оттока ВГЖ. Высоту скана менее 1,2±0,14 мм, высоту ИСК менее 0,14±0,09 мм и наличие гиперэхогенного содержимого в полости ИСК и/или ФП расценивали как признаки несостоятельности путей оттока.

Рис. 3. Динамика интерлейкина 6 до, three days and two months after the surgery in groups with complete (а) и «квалифицированным» (б) гипотензивным успехом (описание в тексте)
Fig. 3. Dynamics of interleukin 6 before, three days and two months after the surgery in groups with complete (a) and qualified (б) hypotensive success (description in the text)

Рис. 4. Динамика изоформ 121 и 165 фактора роста эндотелия сосудов А до, на 3-и сутки и через 2 мес. после операции в группах с «полным» (а) и «квалифицированным» (б) гипотензивным успехом (описание в тексте)
Fig. 4. Dynamics of isoforms 121 and 165 of vascular endothelial growth factor A before, three days and two months after the surgery in groups with complete (a) and qualified (b) hypotensive success (description in the text)
Исследование ЦК слезной жидкости проводили в клинической лаборатории Иркутского филиала ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» методом иммуноферментного анализа (ELISA) с количественным определением уровня интерлейкина 8 (ИЛ-8), интерлейкина 6 (ИЛ-6) и изоформ 121 и 165 семейства фактора роста эндотелия сосудов А (VEGF А) методом твердофазного «сэндвича» с применением моно- и поликлональных антител (на планшете ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Забор слезы осуществляли накануне, на 3-и сутки и через 2 мес. после операции с помощью капилляра-микропипетки из нижнего конъюнктивального свода, оттянув веко и исключив присасывающую функцию слезной точки. Достаточным считали индивидуальный объем слезы в количестве 70±30 мкл. Пробирки со слезой хранили при температурном режиме (–)80 °С до момента исследования.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программ Microsoft Excel и Statistica 8.0. Для оценки гипотензивного эффекта трабекулэктомии построены кривые выживаемости Каплана – Мейера. Для сравнительной оценки уровней ЦК в полученных группах выполнен ANOVA-тест. Достоверными считались результаты с уровнем значимости р<0,05.
Все исследования одобрены локальным этическим комитетом и проведены с соблюдением принципов Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации.
Результаты
Анализ Каплана – Мейера проиллюстрировал кривые выживаемости в группах «полного» (34,9%) (1-я группа) и «квалифицированного» (64,1%) (2-я группа) успеха в зависимости от достигнутого уровня ВГД в различные послеоперационные сроки (рис. 1).
У пациентов 1-й группы (n=29) послеоперационный уровень ВГД составил 16,1±2,1 мм рт.ст. без дополнительной ММТ, у пациентов 2-й группы (n=54) – 19,3±2,4 мм рт.ст., количество дополнительной ММТ – 0,9±0,6. Характеристика УБМ-параметров ИСК и ФП представлена в таблице. Случаев реопераций в исследовании не наблюдалось.
Концентрации ЦК базальной слезы в группах представлены на рисунках 2–4. Перед операцией ИЛ-8 находился на уровне 501,7±165,4 пг/мл в 1-й группе, 933,7±272,7 пг/мл во 2-й группе и 338,28±140,4 пг/мл в 3-й группе (контрольная) (p1–2<0,0001; p1–3<0,01; p2–3<0,0001). На 3-и сутки после операции уровень ИЛ-8 составил 325,1±105,7 пг/мл в 1-й группе и 389,4±176,7 пг/мл во 2-й группе (p1–2=0,07); через 2 мес. – 243,8±126,7 и 231,8±65,7 пг/мл в 1-й и 2-й группах соответственно (p1–2=0,5) (рис. 2 а, б).
Концентрация ИЛ-6 перед операцией составила 21,8±8,7 пг/мл в 1-й группе, 48,3±13,9 пг/мл во 2-й группе и 8,04±4,42 пг/мл в 3-й группе (p1–2<0,0001; p1–3<0,0001; p2–3<0,0001). На 3-и сутки после операции – 34,3±19,2 пг/мл в 1-й группе и 66,1±18,7 пг/мл во 2-й (p1–2<0,0001); через 2 мес. – 13,9±6,05 и 23,45±6,14 пг/мл в 1-й и 2-й группах соответственно (p1–2<0,0001) (рис. 3 а, б).
Динамика изоформ 121 и 165 VEGF А представлена на рисунке 4 а, б. Перед операцией уровень изоформ составлял 851,4±369,4 пг/мл в 1-й группе; 895,8±205,7 пг/мл во 2-й группе и 164,65±120,7 пг/мл в 3-й группе (p1–2=0,5; p1–3<0,0001; p2–3<0,0001). На 3-и сутки – 597,7±224,7 пг/мл в 1-й группе и 712,5±305,7 пг/мл во 2-й (p1–2=0,07); через 2 мес. – 698,5±212,7 и 795,8±270,9 пг/мл в 1-й и 2-й группах соответственно (p1–2=0,09).
Обсуждение
На сегодняшний день не существует максимально эффективного и безопасного способа профилактики и/или лечения рубцевания после фистулизирующих операций, что связано, в том числе, с неполным раскрытием механизмов, лежащих в его основе. Поэтому понимание молекулярных и клеточных аспектов ранозаживления и процессов, их контролирующих, как в норме, так и при патологии имеет первостепенное значение для дальнейшей разработки патогенетически ориентированных профилактических и терапевтических подходов. Выбор в качестве объекта исследования слезной жидкости обусловлен свойствами ее биологической среды, содержащей широкий спектр ЦК, факторов роста и других агентов и характеризующей активность воспалительного и иммунного статуса тканей, с которыми она контактирует. Сроки исследования определяются ожидаемыми изменениями пиковых концентраций ЦК в период между «нулевым» (отсутствие травмы) и 2–5-ми сутками, а также в период, соответствующий фазе ремодуляции рубца [4, 5, 7].
Как известно, заживление делится на непрерывные и перекрывающиеся фазы, включая фазу коагуляции и воспалительного ответа (первые 12–24 ч после травмы); пролиферации, образования внеклеточного матрикса, ангиогенеза и реэпителизации (4–21-е сутки после травмы); фазу созревания и окончательного ремоделирования коллагена, которая может длится от 6 до 12 мес. Любая рана, в том числе послеоперационная, на первых этапах не зависит от характера повреждения, имеет общие механизмы и заживает в строго регулируемом ряду динамических и физиологических процессов. Независимо от этиологии, становление воспаления происходит в форме сочетанной реакции иммунокомпетентных клеток. В течение нескольких часов после альтерации макрофаги запускают синтез ЦК, которые активируют функцию всех иммунных клеток, экспрессируют их рецепторы, усиливают синтез эндотелиальными клетками и лейкоцитами молекул адгезии и ростовых факторов. Одновременно происходит выброс низкомолекулярных медиаторов, таких как гистамин, простагландины и др., ответственных за развитие воспалительной реакции [9, 12]. Вероятно, адекватность реакции воспаления определяется концентрацией и видовым составом ЦК, определяющих функциональную кооперацию клеток для его реализации. При этом кооперация клеток может быть как позитивная, так и негативная. В свою очередь, какие из ЦК являются первостепенными и даже «главными» в регуляции процессов воспаления, фиброзирования и ремоделирования коллагена, до конца не определено.
Как представлено результатами настоящего исследования, в 1-й и 2-й группах, в сравнении с 3-й (контрольной) группой, выявлен повышенный уровень всех исследуемых белковых субстанций уже в предоперационном периоде, что, вероятно, свидетельствует об исходном воспалительном статусе тканей, а также активности заинтересованных клеток и сосудистого эндотелия у пациентов с ПОУГ [12–16]. При этом концентрация ИЛ-8 в группе пациентов с «квалифицированным» гипотензивным успехом достоверно выше, чем в группе с «полным». Примечательно, что ИЛ-8 значимо реагирует на неспецифическую противовоспалительную терапию. Уже на 3-и сутки после операции в обеих группах наблюдается неуклонное снижение этого хемокина на фоне пролонгированной противовоспалительной схемы, достигая уровня предоперационных значений через 2 мес.
Не менее интересна динамика ИЛ-6, продуцируемого макрофагами (одной из основных цитокинпродуцирующих клеток организма), моноцитами, сосудистым эндотелием, а также фибробластами. ИЛ-6 – важнейший медиатор острой фазы воспаления, индуктор системного воспалительного процесса со склонностью к хронизации, сигнальный стимулятор TGF-β и др. [12, 17, 18]. Концентрация ИЛ-6 слезной жидкости исходно повышена в обеих группах, однако имеет тенденцию к численному превосходству в фазу пролиферации во 2-й группе. Разный уровень ИЛ-6 в группах в фазу ремодуляции подтверждает различную активность фибробластов со свойственными им миграционными, пролиферативными и синтетическими способностями в процессе заживления [9, 12].
Неспецифические противовоспалительные агенты (стероиды и НПВС) модулируют воспалительную фазу процесса заживления, уменьшая выработку хемокинов, и пролиферативную фазу, уменьшая пролиферацию фибробластов. Глюкокортикостероиды (ГКС) в инъекциях, инстилляциях, в составе имплантатов с замедленным высвобождением препарата повышают успех трабекулэктомии [19, 20]. Кроме того, результатами ряда исследований определены аддитивные эффекты совместного использования ГКС и НПВС [21]. Однако среди специалистов нет единого мнения относительно дозировки, последовательности и продолжительности их применения в послеоперационном периоде. Полученные результаты обосновывают применение пролонгированных схем ГКС в комбинации с НПВС, а также другими противовоспалительными агентами после ФАВ. Более того, повышенные концентрации ИЛ-6 обосновывают включение при необходимости в послеоперационную схему веществ одновременно с противовоспалительной и иммуномодулирующей активностью (цикроспорин А 0,05%).
Важной частью работы явилась оценка уровня изоформ 165 и 121 VEGF А, участвующих в неоангиогенезе и образовании соединительной ткани в ходе заживления. Данные об эффективности антиангиогенной терапии в качестве адъюванта противорубцовой терапии находятся в стадии исследований. Ряд авторов определяют VEGF как ключевую мишень модуляции заживления после фистулизирующих операций [22, 23]. T. Van Bergen и соавт. показали, что анти-VEGF агенты, направленные против изоформы 165, участвующей в патологическом неоангиогенезе, улучшают хирургические исходы трабекулэктомии в модели на кроликах [24]. Другие авторы сходятся во мнении, что анти-VEGF агенты имеют синергический эффект в улучшении исхода операции лишь в сочетании с антиметаболитами [25, 26]. Дискутабельными остаются вопросы оптимального пути введения, режима дозирования и сроков применения анти-VEGF-агентов в лечении и профилактике рубцевания. H. Lopilly и соавт. продемонстрировали, что фибробласты теноновой капсулы у пациентов с глаукомой экспрессируют изоформы VEGF, а Z. Li и соавт. определили исходное значительное повышение концентрации VEGF во влаге передней камере у пациентов с ПОУГ по сравнению со здоровыми [27, 28].
Настоящее исследование обнаружило повышенные концентрации изоформ 121 и 165 VEGF А в слезной жидкости как в предоперационном периоде, так и после хирургического вмешательства в обеих группах. С одной стороны, исходно повышенную концентрацию VEGF А в слезной жидкости можно рассматривать как компенсаторную реакцию в ответ на хроническую ишемию, обусловленную основным патологическим процессом – глаукомой. С другой, высокие концентрации изоформ VEGF А потенцируют свойственные им эффекты стимуляции процессов васкулогенеза и фиброзирования при ранозаживлении, усугубляя, по-видимому, долгосрочные исходы фистулизирующих вмешательств. Кроме того, высокие концентрации VEGF в обеих группах на протяжение всего периода наблюдения свидетельствуют об отсутствии эффекта неспецифической противовоспалительной терапии в отношение ростовых факторов.
В целом сопряжение воспаления, регенерации и фиброза как завершающего этапа ранозаживления реализуется благодаря макрофагально-фибробластическому взаимодействию при непосредственном участии мощных цитокиновых «петель», обеспечивающих связь между воспалительной и репаративной фазами и регулирующих пролиферацию основной эффекторной клетки репарации – фибробласта, синтезирующего коллаген и протеогликаны [7, 9, 29, 30]. При этом очевидно, что регуляторные возможности относительно финального клеточного элемента регенераторно-репаративного процесса фибробласта до конца не определены.
В целом, несмотря на то что вопрос первоочередности действия тех или иных медиаторов остается открытым, представленное исследование демонстрирует, что клинические признаки неадекватного формирования путей оттока (рубцевания) после ФАВ коррелируют с исходно измененным профилем провоспалительных и проангиогенных ЦК слезной жидкости у пациентов с ПОУГ, которые можно представить в качестве биомаркеров функционального исхода фистулизирующих вмешательств.
Выводы
Формирование путей оттока после ФАВ сопровождается каскадом иммуновоспалительных реакций, обусловленных профилем как провоспалительных, так и проангиогенных ЦК, определяющих ход регенераторно-репаративного процесса.