Рис. 1. 2D-культура ММСК аллогенных фрагментов лимба, световая микроскопия, ув. х100: а) 0 пассаж; б) 4 пассаж
Рис. 2. 3D-культура ММСК, I группа, контроль, световая микроскопия, ув. х100: а) 1 сутки; б) 4 сутки; в) 7 сутки, г) 21 сутки культивирования
В последнее время появляются единичные публикации, в которых авторы в качестве источников клеточной терапии глаукомной оптиконейропатии изучают возможность использования клеток-предшественников олигодендроцитов, клеток Мюллера, ММСК костного мозга [13]. К настоящему времени доступность жизнеспособного клеточного материала и снятие ряда этических проблем, отсутствие признаков трансформации и образования тератом обусловливают широкие перспективы использования ММСК в клинике для клеточной трансплантации и терапии.
В ряде исследований показана эффективность ММСК в восстановлении и регенерации поврежденной нервной ткани в центральной и периферической нервной системе [11, 23]. В единичных экспериментальных работах показана выраженная нейропротекция ГКС после трансплантации ММСК в полость стекловидного тела глаза крысы с индуцированной офтальмогипертензией и признаками оптиконейропатии [11, 12]. При этом патогенетический механизм действия клеточной терапии остается до конца не установленным, однако предполагается, что лечебный эффект ММСК обусловлен интеграцией донорских клеток в тканевые ниши реципиента, секреторной активностью и иммуномодулирующим действием после их трансплантации [22].
Интеграция ММСК при трансплантации требует строительства крайне сложных аксональных связей в сетчатке и в головном мозге реципиента. В 2005 г. Gnecchi M. [10] выдвинул концепцию, согласно которой терапевтический потенциал ММСК в основном связан с секретируемыми в межклеточное пространство биологически активными факторами. В те же годы в работе Crigler L. и соавт. была показана возможность выделения ММСК нейротрофических факторов [8]. Было установлено, что в норме ГКС получают НТФ посредством ретроградного аксоплазматического транспорта [14]. Однако при глаукоме стойкое повышение ВГД приводит к прогибанию решетчатой мембраны и деформации просветов микротубул. В деформируемых канальцах возникают «стригущие» усилия встречных стенок [9], приводящие к компрессии заключенных в суженных канальцах аксонов с последующим нарушением быстрого аксоплазматического тока [16]. Данные изменения запускают механизм патологического апоптоза, обусловливающего прогрессирование каскада гибели клеток, даже на фоне стабилизированного ВГД [18]. В этой связи трансплантация культивированных ММСК в тканевые ниши сетчатки и других внутриглазных структур при глаукомной оптиконейропатии нам представляется патогенетически некорректной и требует дальнейшего поиска адекватных условий клеточной терапии.
Рис. 3. 3D-культура ММСК, II группа, индукция на 1 сутки культивирования, световая микроскопия, ув. х100: а) 1 сутки; б) 4 сутки; в) 7 сутки, г) 21 сутки
Рис. 4. 3D-культура ММСК, III группа, индукция на 7 сутки культивирования, световая микроскопия, ув. х100: а) 1 сутки; б) 4 сутки; в) 7 сутки, г) 21 сутки
В последнее время широко изучаются ММСК лимба, которые относятся к истинным ММСК [17] и могут быть использованы в клинике глазных болезней как альтернатива костномозговым мезенхимальным клеткам [1]. В доступной литературе нам не удалось найти данных об индукции 3D-клеточных культур ММСК лимба, направленной на секрецию наиболее значимых НТФ.
Цель
Изучить в эксперименте in vitro секрецию фактора роста нервов (ФРН) и нейроростового фактора головного мозга (НФГМ) интактными и индуцированными мультипотентными мезенхимальными стволовыми клетками лимба (ММСК) в трехмерной культуре (3D).
Материал и методы
Отбор, выделение и культивирование ММСК лимба
В качестве первичного источника ММСК использовались лимбальные фрагменты глазных яблок доноров-трупов.
Экспериментальные исследования на тканях, выделенных из трупных донорских глаз человека, проводились в соответствии с утвержденными процедурами, законодательными и нормативно-правовыми документами с учетом Лицензии на виды медицинской деятельности Росздравнадзора № ФС-99-01-008251 от 18.02.2013 г., выданной ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.
Для выделения ММСК было использовано 8 глазных яблок от 4 доноров-трупов (табл. 1).
Глазные яблоки от доноров-трупов отбирались с учетом критериев посмертной жизнеспособности клеток по показателю периода после смерти (до 18 час), возрастному лимиту (не более 65 лет) и адреналиновой пробы на клеточную витальность (степени А или В по Борзенку С.А., 2008).
Тканевые фрагменты лимба выделялись по ранее предложенной технике [5]. Для чистоты выделения ММСК лимба механическим путем предварительно удалялся слой переднего эпителия.
Рис. 5. Сфероиды ММСК лимба в условиях 2D-культивирования, 7 сутки, световая микроскопия, ув. х100: а) I, интактная группа; б) II группа; в) III группа
Таблица 1 Основные характеристики трупных донорских глаз человека, использованных в эксперименте
Проведение проточной цитофлуориметрии
Для определения иммунофенотипа полученной культуры клеток применялся метод проточной цитофлуориметрии со следующими маркерными белками: CD90 FITC, CD105 PE, CD73 PE (Biolegend, США), CD133 PE (Miltenyi Biotec GmbH, США), CD19 PE (BD Biosciences, США).
Клетки отмывались от полной ростовой среды раствором Версена, обрабатывались 0,25%-ным раствором трипсина-ЭДТА. Действие фермента инактивировалось добавлением 10 об. % фетальной бычьей сыворотки, подсчитывалось количество клеток и проводилось их центрифугирование (300 g, 5 мин). Полученный осадок ресуспендировался в растворе фосфатно-солевого буфера (рН=7,4) с 1 об. % фетальной бычьей сыворотки и аликвотировался. Каждая пробирка инкубировалась в темноте (при 250 С, 15 мин) с антителами (10 мкл раствора антител на 1 млн. клеток). Полученные результаты анализировались на проточном цитофлуориметре «CytoFLEX» (Beckman Coulter Inc, США).
Проведение индукции секреции нейротрофических факторов ММСК лимба
Индукция секреции НТФ ММСК лимба осуществлялась по двухэтапной методике с использованием неспецифических факторов активации. Первый этап: EGF, hbFGF (ПанЭко, Россия), добавка N2 (Life Technologies, США); второй этап через 72 часа: дибутирил цАМФ, NRG1-beta 1, PDGF (R&D Systems, США), 3-изобутил-1-метилксантин (Santa Cruz Biotechnology, США).
Создание клеточных 3D-сфероидов
Из охарактеризованной 2D-культуры ММСК лимба создавались 3D-сфероиды с использованием неадгезивных 256-луночных агарозных планшетов (3D Petri Dishes, Microtissue, США): I группа – контрольная, без индукции; II группа – с индукцией сфероидов на 1 сутки культивирования; III группа – с индукцией сфероидов на 7 сутки культивирования. Посевная концентрация ММСК составляла 256000 кл/мл.
Световая микроскопия
Таблица 2 Иммунофенотипический анализ экспрессии поверхностных маркеров ММСК лимба в 2D-культуре
Таблица 3 Динамика содержания фактора роста нервов (ФРН) в инкубационной среде в группах сравнения
Проведение иммуноферментного анализа
Для исследования содержания нейротрофических факторов ФРН и НФГМ методом ИФА супернатанты клеточных культур отбирались в разные сроки культивирования и хранились при t=800 C в соответствии с инструкцией производителя (Almabion). ИФА проводился на микропланшетном фотометре «Anthos» (Anthos Labtec Instruments GmbH, Австрия). Статистическая обработка выполнялась на персональном компьютере с использованием стандартных статистических программ.
Результаты
ММСК лимба в условиях 2D-культивирования формировали монослой и имели характерную веретеновидную форму (рис. 1).
Полученная культура клеток лимба экспрессировала характерные для ММСК костного мозга маркеры (CD105, CD90, CD73), практически не экспрессировала маркеры гемопоэтического и лимфоцитарного ряда CD133, CD 19 (табл. 2).
При исследовании динамики сфероидообразования в контрольной группе уже в первые часы инкубирования клетки объединялись в агрегаты (рис. 2a, б), которые к концу 7 суток формировали компактные, плотные сфероиды с гладким поверхностным слоем (рис. 2в).
Во II группе после индукции на 4-е сутки сфероиды приобретали «бугристость» (рис. 3а, б), что было обусловлено стимуляцией пролиферативной активности клеток, формирующих сфероид. Однако в дальнейшем отмечались разрыхление клеточного конгломерата, потеря компактности и появление бахромчатости (рис. 3в), что являлось косвенным свидетельством нежизнеспособности.
В III группе индукция проводилась на 7-е сутки, соответствующие сроку окончания сфероидообразования [3]. При этом индукция вызывала такие же изменения, как и во II группе (рис. 4). Дальнейшая экспозиция клеток в 3D-культуре не приводила к каким-либо морфологическим изменениям сфероидов (рис. 2г, 3г, 4г).
Одним из критериев жизнеспособности сфероидов является их способность к адгезии. В I группе при 2D-культивировании в первые сутки сфероиды прикреплялись к поверхности дна лунок культуральных планшетов и в течение последующих дней «распластывались» с образованием слоя клеток вокруг изначальной зоны их прикрепления. Образуемый клеточный слой являлся неоднородным. Так в центре слоя находился остаток сфероида, а клетки образуемого периферического монослоя по своей морфологии были близки к веретенообразной ворме (рис. 5a). Во II и III группах адгезия отсутствовала, что, скорее всего, свидетельствовало о нежизнеспособности полученных конструкций (рис. 5б, в).
Таким образом, несмотря на литературные данные о необходимости стимуляции плоскостных 2D-культур, для 3D-сфероидов впервые было выявлено отрицательное влияние предложенных индукторов на жизнеспособность клеток.
Динамика содержания нейротрофических факторов ФРН и НФГМ в инкубационной среде по группам исследования представлена в табл. 3 и 4.
При оценке динамики содержания НФГМ в культуральной жидкости в I группе отмечалось умеренное снижение уровня фактора лишь к концу периода наблюдения: к 21 суткам концентрация составляла 461,59±23,09 пг/мл. Индукция во II и III группах способствовала увеличению содержания НФГМ в 1,5 раза и составляла в среднем 870,7±20,2 и 871±18,2 пг/мл соответственно. Однако в дальнейшем отмечалось выраженное снижение продукции в 3,4 и 2,6 раза и к 21 суткам соответствовало 250,5±18,9 и 330±14,1 пг/мл, т.е. в 1,4 раза меньше по сравнению с группой контроля.
Заключение
Клеточные сфероиды, созданные из 2D-культуры интактных ММСК лимба методом трехмерного культивирования, способны в достаточных терапевтических концентрациях спонтанно синтезировать ФРН и НФГМ, являются наиболее оптимальной конструкцией для трансплантации в экстрабульбарные и интраокулярные тканевые ниши глазного яблока, являются потенциальным источником пролонгированной секреции нейроростовых факторов в клеточной терапии оптических нейропатий.
