Рис. 1. А - средняя балльная (по 5-балльной шкале) оценка результатов иммуногистохимического окрашивания эпителия и стромы роговицы с применением антител к GDNF, pERK1/2, GAP43, Bcl2 и Bax. Б – средние значения плотности волокон в строме роговицы (миллиметры на квадратный миллиметр среза)
Рис. 2. Иммуногистохимическая окраска антителами против GDNF (зелёная флуоресценция) трепанированных роговичных дисков больных группы 1 (А), 2а (Б), 2в (В) и 3 (Г). Масштаб на Г - 100 микрометров
На сегодняшний день известно достаточно большое количество факторов, участвующих в процессах реиннервации и регенерации роговицы. Глиальный нейротрофический фактор (Glial cell-derived neurotrophic factor – GDNF), как и многие другие, участвует в процессе реиннервации роговицы и через многокомпонентную систему рецепторов стимулирует пролиферативную активность эпителиальных клеток и кератоцитов [8, 9].
Цель
Анализ результатов проведения СКП у пациентов с деструктивными процессами роговицы или роговичного трансплантата в зависимости от исходного уровня содержания GDNF и активности MAP-киназного каскада сигнальных путей реализации его действия.
Материал и методы
Проведён анализ результатов СКП, выполненной у 23 пациентов (34 глаза) с острым деструктивным процессом (язва, перфорация) роговицы или роговичного трансплантата различной этиологии – после перенесённого кератита 6 человек (8 глаз); при первичных и вторичных эндотелиально-эпителиальных дистрофиях роговицы (ЭЭД) и на фоне аутоиммунных заболеваний (ревматоидный артрит, болезнь Бехчета, синдром Сьегрена) – 8 (12 глаз) и 9 человек (14 глаз) соответственно.
Рекератопластика была выполнена в 12 (36%) случаях, из них повторно – в 8 (67%) и 4 (33%) случаях соответственно. В 4 (33%) случаях рекератопластика была выполнена в сроки до года после предыдущей пересадки в связи с угрозой или перфорацией трансплантата.
В качестве донорского материала использовали консервированные роговицы со средней плотностью эндотелиальных клеток 2787,8±95,3 кл/мм².
Анализ результатов лечения проводился по состоянию роговичного трансплантата в различные сроки после СКП. Срок наблюдения за пациентами составлял от 6 месяцев до 2 лет.
Иммуногистохимическое исследование биологического материала (роговичные диски реципиента) проводилось с использованием антител к GDNF, фосфо-ERK1/2, фосфо-JNK1/2 (Santa Cruz Biotechnology, США), антиапоптозному фактору Bcl2 и его антагонисту Bax (Abcam, Великобритания), к белковому маркеру пролиферации Ki67 (Novocastra Laboratories, Великобритания) и маркеру периферических нервных волокон GAP43 (Acris Antibodies, США).
«Неинформированный наблюдатель» проводил анализ одинаково экспонированных цифровых микрофотографий и оценивал уровень экспрессии исследованных антигенов в роговице по 5-балльной шкале (от интенсивно положительной – 5 баллов до негативной – 0 баллов). Плотность распределения пролиферирующих клеток эпителия определяли посредством подсчёта Ki67 иммунопозитивных клеток с последующим измерением площади эпителия на исследуемом срезе. Иннервацию стромы роговицы оценивали с помощью подсчёта пересечений Gap43 иммунопозитивных волокон с радиусами Мерца в рамке 50× 25 мкм и вычисления длины волокон на единицу площади стромы (мм/мм²) на данном срезе [6]. Достоверность различий оценивали с помощью одностороннего критерия ANOVA, с использованием программы GraphPad Prism.
Результаты и обсуждение
Рис. 3. Иммуногистохимическая окраска трепанированного роговичного диска больного из группы 1 антителами против Bcl2 (А – красная флуоресценция) и Bax (Б - зелёная флуоресценция). Ядра клеток подкрашены бисбензимидом (голубая флуоресценция). Масштаб на Б - 100 микрометров
Рис. 4. Иммуногистохимическая окраска трепанированного роговичного диска больного из группы 2а с помощью антител против GAP43 (А - зелёная флуоресценция) и больного группы 2в с помощью антител против Ki67 (Б – красная флуоресценция). На А видны GAP43-иммунопозитивные нервные волокна возле эпителиального слоя. На Б видны многочисленные Ki67-иммунопозитивные ядра пролиферирующих клеток эпителия. Масштаб на Б - 100 микрометров
В 1-й группе осложнений в послеоперационном периоде не наблюдалось, во 2-й группе в 2 случаях (22%) была выявлена ПЭТР с последующим изъязвлением. В 3-й группе в 16 случаях (89%) наблюдалась персистирующая эрозия трансплантата (ПЭТР), в первые 6 месяцев после СКП в 65% случаев (11 глаз) с рецидивами в 5 случаях, после 6 месяцев – в 35% (6 глаз) с рецидивом в 1 случае.
У пациентов с завершением эпителизации трансплантата до 10 дней и отсутствием развития ПЭТР в дальнейшем (15 глаз) частота прозрачного и полупрозрачного приживления наблюдалась в 67% случаев (10 глаз), у пациентов с развитием ПЭТР и РПЭТР (19 глаз) – в 31% случаев (6 глаз), причём преимущественно в случаях (4 глаза) с формированием ПЭТР в сроки до 6 месяцев после операции. Ретроспективно, с учётом ранее выполненных СКП, было установлено, что на фоне инфекционного и наследственного деструктивных процессов ПЭР и РПЭТР развивались в 68% случаев, на фоне аутоиммунных системных заболеваний – в 89% случаев.
При проведении сравнительного анализа результатов хирургического лечения пациентов и предварительно полученных данных иммуногистохимического исследования периферических отделов трепанированных роговичных дисков было установлено, что у всех пациентов 1-й группы в эпителии удалённой роговицы наблюдалась умеренная позитивная реакция с антителами к GDNF (кластеры GDNF-позитивных клеток чередовались с GDNF-негативными базальными клетками) (рис. 2а) и к фосфо-ERK1/2, в строме – к фосфо-JNK1/2 (по 3 балла) (рис. 1а), что свидетельствовало о наличии умеренно выраженной пролиферативной активности эпителиоцитов и кератоцитов за счёт GDNF и MAP-киназного каскада сигнальных путей. Подтверждением этого являлось значительно более высокое, чем у пациентов 2-й и 3-й групп количество Ki67 – иммунопозитивных клеток в периферических отделах трепанированных роговичных дисков – в эпителии 620±25, в строме – 291±11. Плотность нервных волокон в периферических отделах трепанированных роговичных дисков составляла 32±4 мм волокон на 1 мм² поверхности среза. Иммуногистохимическая реакция с антителами к Bcl2 была умеренно или слабоположительная, к Bax – положительная, что свидетельствовало об активации процессов апоптоза (рис. 3 а, б).
Во 2-й группе пациентов в 5 случаях (группа 2а) была умеренно позитивная реакция с антителами к GDNF (рис. 2б) и слабо положительная реакция с антителами к фосфо-ERK1/2 и фосфо-JNK1/2 (рис. 1а), что свидетельствовало о более низкой активности MAP-киназного каскада сигнальных путей. В 4 случаях (группа 2в) (1 глаз – ПЭТР в последующем, 2 глаза – рекератопластика, 1 глаз – рекератопластика и ПЭТР в последующем) реакция была слабо положительная уже со всеми антителами (рис. 1а, 2в). Количество Ki67 иммунопозитивных клеток у пациентов 2-й группы в эпителии было достоверно меньше (рис. 4б), чем у пациентов 1-й группы (315,8±15, p< 0,05), что подтверждает более длительные сроки эпителизации; в строме в подгруппе 2а достоверно не отличалось (301,7±10, p>0,05), в группе 2в было достоверно меньше (245,7±14, p< 0,05). Плотность нервных волокон в периферических отделах трепанированных роговичных дисков в группах 2а (рис. 4а) и 2в составляла 16,4±2,1 и 8,1±1,3 волокон на 1 мм² (p< 0,05) соответственно. Иммуногистохимическая реакция с антителами к Bcl2 наблюдалась в отдельных фрагментах и была слабоположительная, к Bax – положительная, как и в 1-й группе пациентов (рис. 1а).
В 3-й группе пациентов в 10 случаях (рекератопластика 2 раза – 3 глаза, 3 раза – 1 глаз) иммуногистохимическая реакция со всеми антителами была слабо положительная в отдельных фрагментах, в 8 случаях реакция практически отсутствовала, это были 4 глаза со сроком завершения эпителизации трансплантата более месяца, 4 и 2 глаза с рекератопластикой в 2 и 3 раза соответственно (рис. 1а, рис. 3г). Количество Ki67 – иммунопозитивных клеток в эпителии периферических отделов трепанированных роговичных дисков – было 65,5±5,1, в строме 98±6,5. Плотность нервных волокон в периферических отделах трепанированных роговичных дисков составляла 1,3±0,2 волокон на 1 мм² (p< 0,05), наиболее низкие значения наблюдались у пациентов при рекератопластике (рис. 1б). Иммуногистохимическая реакция с антителами к Bcl2 была практически отрицательная, к Bax – положительная интенсивная и равномерная (рис. 1а).
Между суммарным показателем реакций с антителами к GDNF, фосфо-ERK1/2 и фосфо-JNK1/2 и показателем количества GAP43 иммунопозитивных нервных волокон выявлено наличие положительной корреляционной зависимости (r=0,88; р< 0,05), то есть чем больше снижен уровень GDNF и больше выражена недостаточность MAP-киназного каскада сигнальных путей, тем меньше плотность нервных сплетений в собственной ткани роговицы или трансплантате.
Наличие корреляционной зависимости выявлено также между показателем реакции с антителами к GDNF и показателями реакций с антителами к Bcl2 (r=0,79; р< 0,05) и Bax (r=-0,85; р< 0,05), то есть при снижении уровня GDNF снижается уровень антиапоптозных факторов и запускаются процессы апоптоза.
Заключение
Таким образом, выраженность деструктивного патологического процесса, нарушений процесса эпителизации (увеличение сроков) и формирование осложнений (ПЭТР, РПЭТР с изъязвлениями) в послеоперационном периоде после СКП у пациентов с деструктивными процессами роговицы зависят от степени недостаточности GDNF, снижения активности MAP-киназного каскада сигнальных путей, плотности нервных сплетений в собственной ткани роговицы или трансплантате и повышения активности процессов.
