Прогностический молекулярно-генетический «портрет» увеальной меланомы

    Актуальность

    Увеальная меланома (УМ) – патология органа зрения, представляющая опасность не только для глаза, но и для жизни человека – у 50% пациентов развиваются отдаленные метастазы в течение 10 лет независимо от выбранного метода лечения [3].

    Однако риск развития метастатического процесса при УМ индивидуален, что определяется наличием ряда критериев, имеющих прогностическое значение для диссеминации опухолевого процесса.

    К факторам риска относятся размеры очага, локализация опухоли и вовлечение в процесс цилиарного тела, наличие экстрабульбарного распространения, а также морфологические признаки – клеточный тип и степень дифференцировки. Исследованием хромосомных аномалий (определение копийности 1, 3, 6 и 8 хромосом) и их связи с риском развития метастатического процесса ознаменовалось начало новой эры изучения УМ [4]. В настоящее время особое значение придается молекулярно-генетическому анализу клеточного материала УМ (исследование мутаций в генах GNAQ, GNA11, EIF1AX, SF3B1 и TERT и экспрессии белка BAP1), что, по данным мировой литературы, комплексно проводится лишь в двух центрах – опубликованы результаты молекулярно-генетического исследования на материале 81 [5] и 50 [6] энуклеированных глаз.

    Данных о исследовании мутаций в генах EIF1AX, SF3B1 и TERT при проведении органосохраняющего лечения УМ нет.

    Цель

    Представить собственные результаты комплексного молекулярно-генетического анализа УМ, их прогностическую и клиническую значимость.

    Материалы и методы

    Молекулярно-генетический анализ УМ с прогностической целью был выполнен у 50 пациентов. Средний возраст пациентов составил 50,6 (от 17 до 84) лет. Мужчин было 28, женщин – 22. Высота опухоли варьировалась от 3,7 до 19,5 мм (средняя – 8,7 мм), протяженность составила 13,2 мм (от 8,9 мм до 18,5 мм). В 19 случаях молекулярно-генетический анализ опухоли проводили на энуклеированных глазах. Впервые в отечественной практике выполняли исследование опухоли при проведении органосохраняющего лечения (n=31): у 22 проводили тонкоигольную аспирационную биопсию (ТИАБ) перед брахитерапией, у 9 материал получали при эдорезекции опухоли.

    Забор ткани опухоли при проведении ТИАБ производили двумя доступами: трансвитреально и транссклерально. Биопсию через pars plana с использованием длинных игл 25G (n=6) и 27G (n=10) проводили при опухолях, имеющих постэкваториальную локализацию (n=16). Выполнению ТИАБ через pars plana предшествовало установление порта, соответствующего размеру пункционной иглы. Под контролем операционного микроскопа иглу направляли к максимально удаленной от макулы проминирующей поверхности опухоли. При сомнении в достаточности полученного аспирата выполняли повторную пункцию опухоли. После этого витреоретинальный порт извлекали с наложением узлового эписклерального шва.

    При преэкваториальном расположении опухолей (n=6) выполняли забор опухолевой ткани транссклерально с использованием короткой иглы 30G. Границы опухоли на склере маркировали при проведении трансиллюминации. Далее офтальмологическим лезвием формировали интрасклеральный тоннель на 2 / 3 глубины склеры длиной 2– 3 мм, через который производили вкол иглы в ткань опухоли под острым углом с последующей аспирацией опухолевой ткани. После извлечения иглы на склеру накладывали узловой шов. Непосредственно после этого на проекцию опухоли фиксировали офтальмоаппликатор.

    При эндорезекции МХ (n=9) часть материала удаленной опухоли забиралась отдельно. Техника трансвитреального удаления опухоли и особенности ее гистологической обработки были описаны нами ранее [2].

    Забранный материал помещали в питательную среду для его сохранения и транспортировки в лабораторию.

    После проведения цитологического исследования для определения моносомии 3 хромосомы проводили FISH-реакцию на мазке отпечатка. Использовалась флуоресцентная проба «UroVysion Bladder Cancer Kit» («Abbot Molecular», USA). Оценка результатов проводилась на флуоресцентном микроскопе «Axioscop 2 Plus».

    Поиск мутаций в генах GNAQ (экзон 5), GNA11 (экзон 5), EIF1AX (экзоны 1, 2 и 6), SF3B1 (экзоны 14 и 15) и TERT (промоторная область) в ДНК, выделенной из цитологического или гистологического материала, проводился методом ПЦР с последующим секвенированием продуктов ПЦР. Уровень экспрессии белка BAP1 оценивали иммуноцитохимическим или иммуногистохимическим методом с использованием моноклонального антитела C-4 («Santa Cruz Biotechnology», США).

    Результаты

    Материал, полученный после проведения энуклеации у 20 человек, подлежал обязательному гистологическому исследованию. После забора ткани УМ при органосохраняющем лечении во всех случаях выполняли цитологическое исследование с целью подтверждения наличия опухолевых клеток.

    У 35 пациентов на основании как цитологического материала, полученного при проведении органосохраняющего лечения, так и гистологического материала, полученного при проведении энуклеации, методом FISH определяли потерю одной копии 3 хромосомы, наличие которой ассоциировано с неблагоприятным прогнозом [7, 8].

    У 6 пациентов (17%) обнаружили клетки МХ с нормальным набором хромосом. Моносомия 3 хромосомы была представлена у 29 пациентов (83%) в среднем в 19% (от 3 до 90%) опухолевых клеток.

    Harbour et al. была разработана прогностическая классификация УМ в зависимости от экспрессии различных генов [9]. 1 GEP класс опухолей, как правило, не сопровождается диссеминацией опухолевого процесса. УМ, по генетическим критериям относящиеся ко 2 GEP классу, являются прогностически неблагоприятными. Биологический материал 15 пациентов был отправлен на молекулярно-генетическое тестирование для проведения GEP теста. Панель исследуемых молекулярных маркеров включала мутации в «горячих точках» генов GNAQ, GNA11, EIF1AX, SF3B1 и TERT и экспрессию белка BAP1. В процессе исследования показана пригодность как более объемного материала (глаз (n=3), удаленная опухоль (n=1)), так и материала, полученного при проведении ТИАБ (n=11) для ПЦР-анализа и для иммуноцитохимического исследования.

    Триггерной для развития УМ в 85% является мутация белка G генов GNAQ и GNA11 [10], что определяется на начальном этапе формирования УМ [11]. В ряде случаев определение мутации этих генов может быть ключевым моментом в дифференциальной диагностике УМ [10]. У 8 пациентов по результатам молекулярно-генетического исследования имела место мутация генов GNAQ и GNA11, которая не влияет на риск диссеминации УМ [12].

    Значимыми для определения прогноза развития метастатического процесса являются гены EIF1AX и SF3B1, а также экспрессия белка ВАР1. Мутация гена EIF1AX, выявленная у 3 пациентов, ассоциирована с дисомией 3 хромосомы, относит УМ к GEP 1A классу и свидетельствует о низком риске диссеминации опухолевого процесса [12].

    У двух пациентов иммуноцитохимически определили инактивацию белка BAP1, что свидетельствует о принадлежности УМ к GEP 2 классу и ассоциировано с ранним развитием метастатического процесса [13]. Мутация гена SF3B1, относящая УМ к GEP 1В классу [12], была выявлена у 2 человек, имеющих невысокий риск позднего развития метастатической болезни [10, 12].

    Таким образом, к наиболее достоверным факторам риска развития метастатического процесса УМ относятся мутации в генах GNAQ, GNA11, EIF1AX, SF3B1 и TERT и определение экспрессии белка BAP1, что можно считать молекулярно-генетическим «портретом» УМ. С учетом полученного молекулярно-генетического «портрета» УМ пациентам были рекомендованы различные схемы наблюдения. Пациенты, имеющие УМ с благоприятной генетической картиной, находятся под наблюдением по стандартной схеме, предполагающей проведение ультразвукового исследования органов брюшной полости два раза в год и компьютерной томографии (КТ) легких один раз в год вне зависимости от факторов риска [1]. Пациентам, имеющим генетически верифицированные факторы риска развития метастатической болезни, нами была предложена альтернативная схема наблюдения. Так, пациентам с диагностированной соматической моносомией 3 хромосомы и пациентам, чьи опухоли были отнесены к GEP 1B и 2 классу, рекомендовали проведение магнитно-резонансной томографии органов брюшной полости с контрастированием каждые 3–4 месяца и КТ легких два раза в год с целью раннего выявления метастазов и своевременного их лечения. В ряде случаев пациентам с неблагоприятным прогнозом рекомендовано адъювантное лечение (химиотерапевтическое и иммунотерапевтическое).

    Выводы

    1. Впервые в отечественной практике выполнено исследование опухоли при проведении органосохраняющего лечения.

    2. Впервые в мире проведен комплексный анализ молекулярно-генетического «портрета» УМ при органосохраняющем лечении.

    3. Для выполнения анализа проведен поиск мутаций в генах, наиболее полно отвечающих современному уровню изучения УМ.

    4. Результаты молекулярно-генетического исследования явились основанием практического их применения у пациентов с УМ – предложены альтернативные схемы наблюдения.

    5. Требуется дальнейший проспективный анализ корреляции моносомии 3 хромосомы и мутаций в генах с вероятностью развития метастатического процесса у пациентов с УМ.