Разработка метода получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека и её последующей трансплантации в эксперименте ex vivo

    

    Актуальность

    Патология эндотелиального слоя роговицы различного генеза, включая как первичную генетически детерминированную эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, так и вторичную буллёзную кератопатию, является одной из основных и наиболее часто встречающейся патологией роговицы, требующей проведения оптической кератопластики [1]. Единственным вариантом лечения данных пациентов до сих пор остаётся только выполнение трансплантации роговицы, с заменой всей роговицы или ее части на донорскую. В практике офтальмохирургов у пациентов с эндотелиальной недостаточностью роговицы по-прежнему преобладает метод сквозной кератопластики. Однако стоит также отметить, что в последние 2 десятилетия активно внедряется в клиническую практику более патогенетически обоснованная методика селективной замены эндотелия, а именно задняя послойная кератопластика (ЗПК) [2]. В ходе ЗПК у реципиента удаляется дефектный монослой эндотелия с подлежащей Десцеметовой мембраной (ДМ), после чего на подготовленное ложе трансплантируется предварительно заготовленный донорский послойный трансплантат, состоящий из слоя стромы роговицы, ДМ и эндотелиальных клеток [3]. Толщина заднего послойного трансплантата в среднем составляет 120 мкм. Данная технология имеет массу преимуществ в сравнении со сквозной кератопластикой, одним из основных является исключение необходимости проведения операции по типу «открытого неба», когда глазное яблоко реципиента полностью разгерметизировано. Соответственно, минимизируется вероятность сопряженных с этим операционных осложнений. Также при ЗПК трансплантируется меньшее количество донорской ткани, что, в свою очередь, снижает риск развития реакции отторжения.

    Дальнейшие разработки метода ЗПК привели к её усовершенствованию и созданию метода эндотелиальной кератопластики (ЭК), при которой трансплантируется изолированная ДМ с монослоем эндотелия без стромального слоя роговицы донора (ТЭДМ) [4]. Метод ТЭДМ имеет ряд существенных преимуществ в сравнении с ЗПК, а именно: трансплантируется еще меньший объём донорской ткани, получается более предсказуемый оптический результат операции по причине минимального влияния тончайшего трансплантата (порядка 20 мкм) на послеоперационную рефракцию, улучшаются оптические свойства зоны интерфейса (между подлежащей стромой реципиента и адаптированной трансплантированной ДМ донора). Несмотря на высокую технологичность и результативность метода ТЭДМ, она несет ряд специфических интра- и послеоперационных осложнений: повреждение ДМ в ходе заготовки трансплантата (при отсепаровке от стромы роговицы донора), скручивание мембраны в передней камере глаза реципиента после имплантации, возможность инверсной фиксации трансплантата (эндотелием к строме реципиента), отслойка мембраны в послеоперационном периоде [5].

    В связи с вышесказанным существуют предпосылки для дальнейшего усовершенствования ЭК, при этом одним из путей является трансплантация суспензии эндотелиальных клеток непосредственно в переднюю камеру глаза реципиента. В случае культивирования эндотелиальных клеток донора имеется потенциал существенного увеличения пула клеток, пригодных для трансплантации. Это даст возможность использования одного донора на несколько пациентов. Данный факт может стать решением проблемы дефицита донорского материала, пригодного для проведения ЭК. Еще одним преимуществом технологии имплантации суспензии эндотелиальных клеток реципиенту является возможность использования донорских роговиц с исходно низкой плотностью эндотелиальных клеток. Подобный донорский материал чаще всего отбраковывается, однако он может быть использован для реабилитации пациентов с дисфункцией эндотелия при условии разработки эффективной технологии имплантации суспензии эндотелиальных клеток.

    К настоящему моменту опубликованы лишь две работы по клиническому применению культивированных клеток эндотелия роговицы человека [6, 7]. Стоит отметить, что опытную группу составили пациенты с буллезной кератопатией. Данные работы базировались на серии доклинических исследований, а также на экспериментах с кадаверными глазами (модель ex vivo). Kinoshita с соавт. вводили клетки посредством инъекции в совокупности с ингибитором ROCK-киназы в концентрации 1 ×106 кл/мл. В то время как Parikumar с соавт. использовали нанокомпозитный гель в виде листка с культивированными клетками на его поверхности в концентрации 5 ×105 кл/мл.

    На данный момент на территории Российской Федерации использование культивированных клеточных продуктов регламентируется Федеральным законом №180 «О биомедицинских клеточных продуктах», что ограничивает использование полученных зарубежными коллективами результатов, ввиду применения ими фетальной бычьей сыворотки, используемой при культивировании эндотелиальных клеток [8]. Стоит отметить, что на сегодняшний день нет данных по разработке протокола получения и культивирования эндотелиальных клеток без использования ксеногенных продуктов. Однако применение суспензии нативных (некультивированных) клеток эндотелия роговицы позволяет легитимно использовать данный метод, не входя в противоречие с действующим законодательством. Данный вид трансплантации может рассматриваться как один из вариантов селективной эндотелиальной кератопластики.

    Таким образом, в аспекте вышеизложенного, комплекс вопросов, связанный с трансплантацией нативных клеток эндотелия роговицы в современных условиях на территории Российской Федерации, является крайне актуальным, но не изученным. Трансплантация эндотелиальных клеток роговицы в виде их суспензии имеет потенциал кардинально изменить подход к лечению эндотелиальных патологий роговицы с возможностью быстрого восстановления зрения и уменьшения потребности в донорском материале.

    Цель

    Разработать способ получения суспензии нативных эндотелиальных клеток из кадаверных роговиц человека.

    Материал и методы

    Для разработки способа получения суспензии нативных эндотелиальных клеток использовали 20 корнеосклеральных дисков, выделенных из энуклеированных глаз экспериментальных животных (свиньи), и 28 кадаверных корнеосклеральных дисков, выделенных от доноров-трупов человека. Средний возраст доноров составил 56±16 лет, срок от момента смерти до ввода в эксперимент не превышал 7 суток. Для получения культуры клеток были использованы следующие способы выделения: механический, энзимный, а также предложенные в ходе эксперимента модифицированные варианты указанных способов.

    Механический способ выделения

    Механический способ выделения отрабатывали на 10 корнеосклеральных дисках экспериментальных животных (свиньи) и 3 корнеосклеральных дисках кадаверных глаз. Выделение эндотелиальных клеток проводили путём механического смыва с эндотелиальной поверхности корнеосклерального лоскута (роговица с 3,0 мм ободком склеры) потоком жидкости. Смыв осуществляли с использованием 5 мл раствора для хранения роговицы (ТУ №9398-013-29039336-2008, ООО «НЭП Микрохирургия глаза», Москва) канюлей 30G. Для определения эффективности метода после смывов проводили окрашивание ДМ роговицы раствором трипанового синего (0,15%, Membraneblue-DUAL, Нидерланды).

    Энзимный способ выделения

    Энзимный способ выделения отрабатывали на 10 корнеосклеральных дисках экспериментальных животных и 3 корнеосклеральных дисках кадаверных глаз. Выделение клеток с корнеосклерального лоскута проводили путем инстилляции раствора фермента объемом 1 мл (время воздействия определялось по рекомендациям производителя) на эндотелиальную поверхность роговицы. Использовали следующие ферменты: раствор Трипсин-Версен (ПанЭко; Россия), раствор Аккутазы (Thermo scientific, США), представляющий собой протеолитический и коллагенолитический фермент, и рекомбинантный фермент неживотного происхождения TrypLE (Invitrogen, США) пригодный для клинических и трансляционных исследований.

    Далее осуществляли атравматичную аспирацию полученной суспензии при помощи канюли 27G. Для деактивации фермента в полученную суспензию клеток добавляли раствор для хранения роговицы с последующим центрифугированием для удаления оставшегося фермента. Для определения эффективности метода эндотелиальную поверхность корнеосклерального диска окрашивали раствором трипанового синего.

    Модифицированный механический способ выделения

    Модифицированный механический способ выделения отрабатывали на 8 кадаверных корнеосклеральных дисках. Данный способ включал в себя иссечение роговичного диска диаметром 12 мм трепаном, для исключения попадания посторонних клеточных компонентов в суспензию. Далее производили смыв эндотелиальных клеток 5 мл раствора для хранения роговицы канюлей 30G.

    Модифицированный энзимный способ выделения

    Модифицированный энзимный способ выполняли путём предварительного выкраивания изолированной десцеметовой мембраны (ДМ) с эндотелием на 12 кадаверных роговицах. ДМ переносили в пробирку типа Эппендорф, добавляли 0,3 мл TrypLE (Invitrogen, США) и помещали в термошейкер 300 rpm, 370С, в течение 5 мин. Инактивация проводилась 10-кратным разбавлением полученной суспензии раствором для хранения роговицы, с последующим центрифугированием в течение 5 мин, 900 rpm, 37°С.

    Определение чистоты получаемой суспензии Из полученных образцов забирали 100 мкл раствора, предварительно взбалтывали на вортексе Biosan (Biosan, Латвия) и переносили в пробирку для проточного цитофлуориметра Cyto Flex (Beckman Coulter, США). Анализ чистоты получаемых образцов проводили по соотношению размеров и количества частиц.

    Определение жизнеспособности полученной суспензии

    Для определения жизнеспособности клеточных суспензий, полученных указанными способами, проводили окрашивание клеток флуоресцентным набором Live and Dead (Abcam, Великобритания), с последующим анализом на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Olympus FV 10i (Olympus, Япония). А также оценивали способность полученной клеточной суспензии к адгезии. Для этого полученные клеточные суспензии культивировали в питательной среде, содержащей DMEM/F12 (Invitrogen, США), 2%FBS (Invitrogen, США), 1% раствор антибиотиков (Invitrogen, США), 1% GlutaMAX (Invitrogen, США), в культуральных 24-х луночных планшетах (Corning, США). Культивирование проводилось в течение 7-ми дней, при стандартных условиях.

    Анализ изображений и статистическая обработка материала

    Полученные изображения были обработаны с помощью программного обеспечения (ПО) ImageJ (National institutes of health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin, США). Статистическую обработку полученных в ходе эксперимента данных осуществляли на персональном компьютере с ПО Prisma 8.0. Для оценки полученных данных использовали методы параметрической и непараметрической описательной статистики с определением средней арифметической величины (М) и стандартного отклонения (±σ). Статистическую значимость различий между группами оценивали с использованием дисперсионного анализа (ANOVA). Различия сравниваемых показателей принимали достоверными при уровне значимости р<0,05.

    Результаты

    Механический способ выделения

    Для определения эффективности механического способа выделения эндотелиальных клеток роговицы после каждого смыва производили окрашивание трипановым синим. Полученный результат фотографировали с последующей обработкой в ПО ImageJ, с расчетом процента площади, окрашенной трипановым синим. Было выявлено, что применение 3-х смывов 5 мл раствора для хранения роговицы является наиболее оптимальным (рис. 1, табл.). Статистически значимых различий между свиными роговицами и кадаверными роговицами выявлено не было.

    Энзимный способ выделения

    Полученные данные показали, что наибольший результат был в группе с применением рекомбинантного

    фермента TrypLE (при окраске трипановым синим площадь составила 15% ± 4%)(рис. 2), при применении Аккутазы и раствора трипсин-Версена площадь ДМ без эндотелиальных клеток составило 7% ± 3 и 10% ±4 соответственно. Столь низкие результаты были получены вследствие отсутствия прямого механического воздействия. Статистически достоверных различий между свиными роговицами и кадаверными получено не было.

    Модифицированный механический способ

    Было показано, что при данном способе выделения эффективность метода не меняется и остается на том же уровне, как и при механическом способе выделения (рис. 3). Однако отмечалась сложность работы с образцом вследствие отсутствия склерального кольца как более безопасного участка ткани для фиксации материала пинцетом при обработке.

    Модифицированный энзимный способ

    Данный способ выделения включает одновременное энзимно-механическое воздействии на ДМ и эндотелиальные клетки, а также возможность контроля под световым микроскопом остаточных клеток на ДМ, что обеспечивает полное удаление эндотелиальных клеток с ДМ.

    Определение чистоты получаемой суспензии

    При анализе чистоты суспензии было выявлено, что механический и модифицированный механический способ выделения не исключают попадания крупных посторонних частиц (рис. 4). Однако стоит подчеркнуть, что в модифицированном способе отсутствовали пигментные клетки, которые скорее всего попадали в суспензию из трабекулярной сети и из радужки (остатков цилиарного тела). При сравнительном анализе чистоты суспензии на проточном цитофлуориметре было показано достоверное различие (р=0,01) между механическими способами выделения (рис. 5).

    При анализе чистоты суспензий, полученных энзимными способами, было выявлено, что в растворе отсутствовали крупные частицы. При модифицированном энзимном способе также отмечали отсутствие клеточных структур различной морфологии, отличающихся от эндотелиальных клеток роговицы (рис. 6). При сравнительном анализе на проточном цитофлуориметре также было показано статистически достоверное различие (р=0,01) между способами выделения (рис. 7). При сравнении модифицированных способов выделения суспензии эндотелиальных клеток было выявлено статистически достоверное различие (p<0,05). Более низкие результаты загрязнения различными частицами были показаны при модифицированном энзимном способе (рис. 8).

    Определение жизнеспособности получаенных суспензии

    При определении степени адгезии культивированных клеточных суспензий достоверных различий выявлено не было. Однако в группах механического способа выделения в основном отмечали адгезию крупных конгломератов клеток(рис. 9), тогда как при энзимном способе отмечали адгезию лишь единичных клеток (рис. 10). Жизнеспособность эндотелиальных клеток в суспензиях, полученных модифицированными способами, не отличалась (рис. 11).

    Заключение

    Проведенное экспериментальное исследование является первым этапом к созданию метода имплантации суспензии эндотелиальных клеток для лечения пациентов с патологией эндотелиального слоя роговицы. В настоящий момент мы определили вариант, наиболее подходящий для дальнейшего применения, – модифицированный энзимный метод, который позволил получить наибольшее количество жизнеспособных клеток при наименьшем проценте загрязнения суспензии посторонними частицами. В дальнейшем мы планируем эксперименты, основной целью которых будет достижение максимально возможного количества некультивированных жизнеспособных изолированных эндотелиальных клеток в полученной суспензии. Также запланирована разработка методов и инструментария для имплантации полученной суспензии в переднюю камеру глаза.

    Учитывая факт отсутствия в доступной нам литературе сведений по аналогичным разработкам и применению способов лечения патологии эндотелиального слоя роговицы с использованием некультивированных эндотелиальных клеток, находящихся в виде суспензии, а не фиксированных к поверхности ДМ, мы не можем провести сравнительный анализ результатов нашего эксперимента. Стоит отметить, что положительные клинические результаты, полученные группами зарубежных учёных, при использовании культивированных эндотелиальных клеток, являются предпосылкой широкого распространения данной технологии для клеточной эндотелиальной кератопластики.

    Следует подчеркнуть, что развитие технологий не может проводиться в отрыве от контекста нормативно-правовых аспектов национального регулирования конкретного государства. В связи с чем задачей сообщества российских учёных является работа над созданием новых перспективных технологий, дающих возможность их использования на территории РФ. Разработка комплексного алгоритма лечения пациентов, имеющих различную этиологию и стадии эндотелиальной дисфункции роговицы, представляется нам крайне актуальной задачей отечественной офтальмологии.

    Впервые предложены четыре способа получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы. Показано,

    

    

    Информация об авторах

    Борис Эдуардович Малюгин, д.м.н., профессор, boris.malyugin@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-5666-3493

    Сергей Анатольевич Борзенок, д.м.н., профессор, mdborzenok@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-9160-6240

    Дмитрий Сергеевич Островский, к.б.н., научный сотрудник, dmitriy.ostrovskiy@ gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-2817-7102

    Ольга Павловна Антонова, к.м.н, antonova.mntk@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-7414-0511

    Мадина Хетаговна Хубецова, к.м.н., porporina@inbox.ru, https://orcid.org/0000-0002-6378-8750

    Нино Романовна Цикаришвили, ординатор, nino1996nino@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-4084-7794

    Information about the authors

    Boris E. Mal

Рис. 11. Определение жизнеспособности полученной суспензии эндотелиальных клеток: а) модифицированный механический способ; б) модифицированный энзимный способ. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, живые клетки (зелёные), мертвые клетки (красные) ув. 100х
Fig. 11. Determination of the viability of the obtained suspension of endothelial cells а) modified mechanical method; б) modified enzymatic method. Laser scanning confocal microscopy, live cells (green) dead cells (red) 100x

yugin, PhD, Doctor of Sciences in Medicine, Professor, boris.malyugin@gmail.com, https://orcid.org/0000-0001-5666-3493

    Sergey A. Borzenok, Doctor of Science (Medicine), Professor, mdborzenok@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0001-9160-6240

    Dmitriy S. Ostrovskiy, PhD in Biological Sciences, researcher, dmitriy.ostrovskiy@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-2817-7102

    Olga P. Antonova, PhD in Medical Sciences, antonova.mntk@gmail.com, https://orcid.org/0000-0002-7414-0511

    Madina K. Khubetsova, PhD in Medical Sciences, porporina@inbox.ru, https://orcid.org/0000-0002-6378-8750

    Nino R. Tsikarishvili, Resident, nino1996nino@mail.ru, https://orcid.org/0000-0003-4084-7794

    Вклад авторов в работу:

    Б.Э. Малюгин: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    С.А. Борзенок: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    Д.С. Островский: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, написание текста.

    О.П. Антонова: сбор, анализ и обработка материала, написание текста.

    М.Х. Хубецова: сбор, анализ и обработка материала, редактирование.
    Н.Р. Цикаришвили: редактирование.

    Authors'contribution:

    B.E. Malyugin: significant contribution to the concept and design of the work, final approval of the version to be published.

    S.A. Borzenok: significant contribution to the concept and design of the work, final approval of the version to be published.

    D.S. Ostrovskiy: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis, and processing of material, writing.

    O.P. Antonova: collection, analysis, and processing of material, writing.

    M.K. Khubetsova: collection, analysis, and processing of material, editing.

    N.R. Tsikarishvili: editing.

    Финансирование: Авторы получили грант в конкурсе «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами» (2021). Название гранта «Разработка метода получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека и ее последующей трансплантации в эксперименте ex vivo». Номер: 22-25-00356

    Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Funding: The authors received a grant in the competition «Conducting fundamental scientific research and exploratory scientific research by small individual scientific groups» (2021). The name of the grant is «Development of a method for obtaining a suspension of human corneal endothelial cells and its subsequent transplantation in an ex vivo experiment». Number: 22-25-00356

    Patient consent for publication: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.

    Conflict of interest: Тhere is no conflict of interest.

    Поступила: 09.11.2022

    Переработана: 14.11.2022

    Принята к печати: 16.11.2022

    Originally received: 09.11.2022

    Final revision: 14.11.2022

    Accepted: 16.11.2022