Регенеративные процессы в тканях глаза при имплантации механоактивированного биологического материала

     Совершенствование технологий, направленных на лечение дегенеративно-дистрофических заболеваний органа зрения, имеет не только большое научное, но и медицинское значение в виду высокой частоты данных нарушений и отсутствия тенденции к их снижению [16, 17, 29].

    В настоящее время с Целью активации репаративных процессов в тканях глаза всё шире используются аллогенные биоматериалы, применение которых основано на их резорбции и замещении, что, в свою очередь, позволяет избежать рубцевания и достичь полноценной регенерации тканей [10-12, 20, 22]. Выявлено, что основной эффект применения биоматериалов заключается в стимуляции регенерации паренхиматозных структур и дифференциации клеточных элементов тканей реципиента [20]. Различные биологические материалы активно используются в настоящее время в офтальмологической практике в виде макроскопических имплантатов [2, 5-8, 18, 30, 33-40], которые в процессе своего рассасывания образуют депо биологически активных веществ, ускоряющих регенерацию тканей реципиента и стимулирующих процессы васкуляризации [4, 10-12, 14, 15, 20, 32]. Однако все процессы регенерации при таких аллопластических пересадках протекают только на поверхности наружной фиброзной оболочки глаза, без вовлечения в репаративные преобразования стромы и глубоких слоёв склеры, что было бы полезно при её дегенеративно-дистрофических заболеваниях.

    Проведенные исследования, посвящённые изучению регенерации пересаженного биологического материала, показали, что при уменьшении дисперсности имплантата (в микрометровом диапазоне) увеличивалась степень его взаимодействия с тканями реципиента [20]. Поэтому использование мелкодисперсных имплантатов из биологических материалов, способных глубоко проникать, вызывая репарацию и ангиогенез в прилежащих тканях реципиента, тем самым восстанавливать их трофику и функцию, может значительно расширить возможности медицины в комплексном лечении глазных заболеваний.

    В настоящее время существуют методики по изменению биофизических свойств исходного материала, направленные на повышение эффективности взаимодействия с тканями реципиента, в частности интенсивное внешнее воздействие. Основными методами интенсивного внешнего воздействия для изменения биофизических свойств материалов и лекарственных форм в настоящее время являются воздействие ультрафиолетовым излучением, использование лазерного излучения и механоактивация.

    Воздействие ультрафиолетового излучения на соединительную ткань глаза вызывает образование связей-мостиков между разрозненными коллагеновыми фибриллами фиброзной оболочки глаза, объединяя их в единую прочную сеть, дающее возможность остановить, в частности, прогрессирующую эктазию роговицы, не прибегая при этом к оперативному вмешательству [3, 19, 21]. Однако применение данной технологии не стимулирует процессы коллагеногенеза в зоне воздействия, а повышение продукции свободных радикалов вследствие воздействия ультрафиолетового излучения может приводить к разрушению мембран клеток, в частности кератоцитов. Использование лазерной энергии позволяет изменить стереоизомерные свойства биологического материала [1], повысить при этом биосовместимость, однако не влияет на дисперсность исходного материала, тем самым не улучшает его биодоступность. Механоактивация, которую мы использовали в наших исследованиях, предполагает обработку исходного материала в шаровых планетарных мельницах путём измельчения в ударном режиме. При этом, как правило, происходит повышение химической активности вещества. Так, в частности, повышение дисперсности и перевод в аморфное состояние привели к повышению лекарственной эффективности глюконата кальция [9, 13, 31].

    Использование метода механоактивации в приготовлении биологических материалов с изменением их структуры до наноразмерных форм в известных литературных источниках не найдено. Учитывая относительную простоту методики, а также возможность получения новых, вследствие изменения размерности, биофизических свойств исходного вещества (биодоступность, гидрофильность, повышенная проницаемость и т.д.) метод является весьма перспективным в получении биологических материалов.

    Цель

    Оценка репаративной регенерации в тканях глаза, возникающей при имплантации механоактивированного биологического материала на основе плаценты человека в соединительно-тканные структуры глазного яблока в условиях эксперимента.

    Материал и методы

     Нами был получен механоактивированный биологический материал на основе плаценты человека путём измельчения в шаровой планетарной мельнице «Pulverezette 7» (Fritsch, Германия) при температуре не более 600 С и величины подведенной удельной энергии 0,4-100 кДж/г [23]. При этом механоактивированный биологический материал на основе плаценты человека был представлен порошком, состоящим из отдельных частиц размером от 200 до 500 нм, которые образовывали слабосвязанные агломераты размером от 2 до 10 мкм (рис. 1). Частицы, в свою очередь, были сформированы отдельными зёрнами с размером от 40 до 100 нм (рис. 2).

    Для дальнейшего применения в условиях эксперимента полученный порошок механоактивированной плаценты помещали в отрезок сосуда пуповины, и концы завязывали шовным материалом (шёлк 8,0). В последующем полученный биологический контейнер (БК) консервировали в 0,2% спиртовом растворе тимола, содержащего хлорид лития [24].

    Эксперименты по имплантации БК с механоактивированной плацентой производили in vivo на 72 половозрелых кроликах (144 глаза) породы Шиншилла в возрасте от года до двух лет обоего пола с массой тела от 3,0 до 3,5 кг.

    В первой опытной группе производили разрез конъюнктивы глаза животного в верхне-наружнем квадранте, в сформированный тоннель к заднему полюсу глаза на склеру укладывали БК, заполненный механоактивированной плацентой человека (рис. 3). Второй опытной группе производили имплантацию БК, заполненного крупноизмельчённой (исходной, до механоактивации) плацентой (рис. 4). Животным первой контрольной группы имплантировали отрезок сосуда пуповины без заполнения каким-либо биологическим материалом. Животным второй контрольной группы производили только разрез конъюнктивы без имплантации биологического материала.

    Экспериментальные исследования проведены с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», одобрены Комитетом по биомедицинской этике ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия» Минздрава России (протокол № 426 от 02.09.2014 г.). Кроликов выводили из эксперимента методом воздушной эмболии под тиопенталовым наркозом (30 мг/кг внутримышечно). При этом морфологию тканей глаз животных изучали через 3, 7, 14, 30, 60 и 90 суток после имплантации. Применяли световую микроскопию с окрасками срезов гемотоксилин-эозином, по Ван-Гизон, атомно-силовую микроскопию (Интегра Прима, НT-MДT, Россия), лазерную конфокальную микроскопию и спектроскопический люминисцентный анализ (Интегра Спектра, НT-MДT, Россия), иммуногистохимическое исследование с определением экспрессии к белкам Ki-67, Caspase-3 и виментину.

    Результаты и обсуждение

    В ходе проведённых экспериментальных исследований отмечено, что послеоперационный период у кроликов протекал без видимых осложнений. Наблюдалась умеренная гиперемия конъюнктивы глазного яблока животного, в единичных случаях незначительное слизисто-гнойное отделяемое.

    В первых трех изучаемых группах рассасывание имплантата наблюдалось на протяжении всего периода наблюдения, при этом более выраженный лимфоцитарно-клеточный ответ был в первой опытной группе при введении БК с механоактивированной плацентой. Кроме того более выраженные регенераторные процессы в зоне нахождения БК, а также на удалении от него на расстоянии до 500 мкм, в виде фибробластических реакций, коллагенообразования и неоваскулогенеза наблюдались также в первой опытной группе. Отмечено повышение регенераторной активности в первой опытной группе в 1,4 раза более в сравнении с введением крупнодисперсного аналога и в 2,6 раза в сравнении с разрезом без имплантации биологического материла, что подтверждалось иммуногистохимическими методиками исследования с выявлением уровня экспрессии Ki-67. В группе животных с разрезом конъюнктивы клеточная реакция в области хирургической манипуляции была минимальна, а сама зона характеризовалась типичным для данного вида травмы рубцеванием.

     Достоверно отмечено проникновение частиц механоактивированной плаценты на 2/3 глубины склеры под БК с 7-х суток наблюдения, тогда как в остальных группах животных все процессы наблюдались только на поверхности склеры (рис. 5).

    Разработанной авторской методикой определения степени зрелости коллагенового волокна изучены коллагеновые волокна склеры глаза кролика в зоне имплантации БК [25].

    При этом АСМ-методом по оценке механической жёсткости и степени разрешённости поперечной D-исчерченности коллагенового волокна за период наблюдения в первой опытной группе в склере под имплантированным БК с механоактивированной плацентой достоверно отмечено появление новообразованных коллагеновых волокон (табл. 1). Во второй опытной и последующих контрольных группах изучаемых животных незрелые (новообразованные) коллагеновые волокна АСМ-методом в изучаемых участках склеры в зоне хирургической манипуляции не обнаруживались.

    Таким образом, имплантация БК с механоактивированной плацентой запускает механизмы репаративной регенерации в виде фибробластогенеза, коллагенообразования и неоваскулогенеза в зоне имплантации на поверхности фиброзной оболочки глаза. Кроме того, наблюдается проникновение частиц механоактивированной плаценты до глубоких слоев подлежащей склеры с последующим в ней процессом коллагенообразования, что не было ранее отражено в доступной нам литературе.

    Выводы

    1. Созданный механоактивированный биологический материал на основе плаценты человека имеет мелкодисперсную основу с размерами частиц вещества 40-100 нм, обладает высокой диффузионной способностью с сохранением дисперсности после введения в ткани реципиента, в том числе и в плотную волокнистую соединительную ткань (склеру).

    2. Образование механоактивированной плацентой агломератов размерами 2-10 мкм за счет физической адгезии приводит к клеточному ответу тканей реципиента, в частности к макрофагальной активности, что является пусковым моментом в индуцировании процессов репаративной регенерации.

    3. Отмечено повышение пролиферативной активности в зоне введения механоактивированной плаценты в 1,4 раза более в сравнении с введением крупнодисперсного аналога и в 2,6 раза – в сравнении с разрезом без имплантации биологического материла.

    4. Отмечено формирование вновь образованных коллагеновых волокон в склере глаза животного в зоне имплантации механоактивированной плаценты, что говорит о глубокой (интрамуральной) регенерации.

    Поступила 16.03.2016.