Ремоделирование внеклеточного матрикса при увеальной меланоме человека

    Актуальность

    Микроокружение опухоли является специфичной неоднородной средой, окружающей опухоль, состоящей из кровеносных и лимфатических сосудов, стромальных и иммунных клеток, клеток-предшественников, сигнальных молекул и внеклеточного матрикса (ВКМ) [1]. Совокупность всех компонентов микроокружения опухоли осуществляет транспорт питательных веществ и сигнальных молекул, секрецию факторов и цитокинов, а также формирует механический каркас для опухоли. Взаимодействие опухолевых клеток с компонентами микроокружения опухоли способствует активации сигнальных путей, направленных на канцерогенез, избегание иммунного надзора и развитие лекарственной устойчивости [2].

    Ключевым элементом микроокружения опухоли является ВКМ – организованная трехмерная сеть макромолекул, поддерживающая целостность тканей и органов. Архитектура ВКМ включает в себя интерстициальный матрикс и базальную мембрану (БМ). Интерстициальный матрикс в основном состоит из фибриллярных коллагенов, фибронектина (ФН), эластина, гиалуроновой кислоты и других компонентов, в то время как БМ – из коллагена типа IV, ламинина и нидогенов [3]. Главным источником синтеза компонентов ВКМ являются активированные опухоль-ассоциированные фибробласты (ОАФ) [4]. ВКМ способствует формированию механического каркаса для опухолевых клеток, участвует в регуляции сигнальных каскадов, влияющих на фенотип стромальных и иммунных клеток, и модулирует процессы метастазирования, ангиогенеза и пролиферации опухолевых клеток [4].

    Известно, что ВКМ является динамической структурой, состав которой может изменяться в зависимости от внешних и внутренних факторов. Ремоделирование ВКМ представляет собой сложный процесс деградации и обновления сети макромолекул [5], однако при онкопатологии под действием факторов, секретируемых опухолевыми клетками, и матриксных металлопротеиназ (MMPs), продуцируемых ОАФ, ВКМ подвергается более сложным структурным изменениям для поддержания процессов канцерогенеза и развития лекарственной устойчивости [5]. Изменения в ВКМ могут быть вызваны гипоксией и нехваткой питательных веществ в связи с ростом и пролиферацией опухолевых клеток, а также активными формами кислорода, образующимися при инфильтрации иммунными клетками [6].

    Увеальная меланома (УМ) является наиболее распространенной внутриглазной злокачественной опухолью, развивающейся из пигментных клеток хориоидеи. Известно, что метастазы УМ диагностируются у 50% пациентов независимо от типа лечения [7] и являются основной причиной смертности пациентов с УМ. Метастатическое распространение происходит гематогенным путем и поражает преимущественно печень (90%), легкие (30%) и реже – кости (15%) [8]. Метастазы в лимфатических узлах встречаются крайне редко и возникают преимущественно в случаях вторичного экстраокулярного распространения опухоли, которое встречается примерно в 10% случаев УМ [8]. Несмотря на успехи в развитии новых методов терапии УМ, средняя выживаемость при метастазировании составляет примерно 5–10 месяцев [7].

    Показано, что микроокружение опухоли, в частности ВКМ, регулирует сигнальные пути, связанные с метастазированием и формированием устойчивости к терапии [6]. Для блокирования протуморогенных свойств ВКМ в случае опухолей, для которых характерно накопление фибриллярных компонентов, фармакологическое снижение экспрессии коллагенов и ФН приводило к повышению эффективности терапии [2]. Предполагается, что опухоли способны формировать уникальный опухоль-специфичный архитектурный тип ВКМ: для некоторых типов рака свойственно накопление компонентов ВКМ для регуляции сигнальных путей ангиогенеза, роста и пролиферации; в других случаях повышаются процессы деградации компонентов ВКМ для облегчения инвазии и метастазирования [6]. Так, например, для УМ характерно разрушение коллагенов I и IV типов под действием MMP2, MMP9 и MMP14, секретируемых ОАФ [9]. Также известно, что при меланоме кожи наблюдается накопление (ФН), гликопротеина, определяющего механический каркас и передачу сигналов для миграции и роста опухолевых клеток [10]. Несмотря на успехи в исследованиях канцерогенеза УМ, в настоящее время роль отдельных компонентов ВКМ в патогенезе УМ является недостаточно изученной и требует детального исследования [11].

    Таргетное воздействие на компоненты ВКМ рассматривается как одно из перспективных направлений в разработке новых подходов к терапии рака [12]. Целью такой терапии является имитация естественной структуры и функций ВКМ для блокирования сигнальных путей, способствующих избеганию иммунного надзора и выживаемости опухолевых клеток [12]. Также особенности ремоделирования ВКМ могут быть использованы для подбора оптимальных путей доставки лекарств. Например, накопление ФН наблюдается при многих типах рака, и пептиды, которые связываются с EDB-доменом ФН, могут быть использованы для доставки экзосом, содержащих противоопухолевый препарат [13]. Таким образом, исследование структурных особенностей и процессов реорганизации ВКМ может способствовать разработке новых подходов в терапии УМ.

    Цель

    Целью данного исследования является оценка экспрессии маркеров, связанных с ремоделированием ВКМ при УМ.

    Материал и методы

    В качестве объекта исследования были использованы фрагменты энуклеированных по медицинским показаниям глаз пациентов Новосибирского филиала ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. Энуклеацию проводили при УМ (n=15). Каждому пациенту было проведено стандартное офтальмологическое обследование для подтверждения диагноза и исключения следующих патологий: неоваскулярная глаукома, сахарный диабет 1-го и 2-го типов, аутоиммунные процессы любой локализации. Для иммуно-гистохимического исследования были взяты фрагменты опухоли и биологические образцы постэкваториальной зоны хориоидеи без опухолевого роста.

    Исследование проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека», Федеральным законом Российской Федерации от 21.11.2011 № 323 ФЗ «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации», а также требованиями Федерального закона от 27.07.2006 № 152-ФЗ (ред. от 21.07.2014) «О персональных данных» (с изм. и доп., вступ. в силу с 01.09.2015). На проведение исследования получено разрешение локального этического комитета НИИКЭЛ – филиал ИЦиГ СО РАН (протокол № 180 от 28.04.2023). Сбор материала и получение письменного информированного согласия на исследование биологического материала и использование полученных данных в научных целях осуществляли сотрудники Новосибирского филиала ФГАУ НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.

    Образцы хориоидеи и опухоли фиксировали в 4%-ном растворе формальдегида, обрабатывали по стандартной гистологической методике и заливали в парафин. Срезы ткани депарафинизировали, регидратировали. Иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием системы детекции 2-step plus Poly-HRP Anti Mouse/Rabbit IgG Detection System (Elabscience, Китай) согласно руководству производителя. Срезы гибридизировали с первичными антителами к αSMA (Abcam, Великобритания), Collagen I (Invitrogen, США), FN1 (Elabscience, Китай), MMP2 (Abcam, Великобритания), MMP14 (Elabscience, Китай), TIMP2 (Abcam, Великобритания) в течение ночи при +4°С и далее с соответствующими вторичными поликлональными антителами козла к IgG кролика или мыши (Abcam, Великобритания), конъюгированными с пероксидазой хрена в течение 1 ч при +25 °С. После гибридизации срезы отмывали, контрастировали раствором гематоксилина, дегидратировали и заключали в монтирующую среду. Цифровые микрофотографии получали на микроскопе Axio Scope. A1 (ZEISS, Германия) с использованием CCD камеры Axiocam 512 color (ZEISS, Германия) и программного обеспечения ZEN 2.3 (ZEISS, Германия) центра коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов СО РАН.

    Морфометрию цифровых изображений (n=10 полей зрения/пациент), полученных в результате иммуногистохимического окрашивания, проводили с помощью программного обеспечения Image J (Wayne Rasband, США). При исследовании αSMA( + )-зон оценивалась относительная площадь окрашивания (в процентах). Результаты иммуногистохимического окрашивания оценивали с использованием иммунореактивной шкалы [14]. Площадь и интенсивность положительного окрашивания оценивали по балльной системе. Площадь окрашивания оценивалась как «0» (<1%), «1» (1–25%), «2» (>25–50%), «3» (>50–75%) или «4» (>75%). Интенсивность окрашивания оценивали как «0» (отсутствие окрашивания), «1» (слабое окрашивание), «2» (умеренное окрашивание) или «3» (сильное окрашивание). Суммарный балл экспрессии белков рассчитывали по формуле: площадь × интенсивность окрашивания.

    Среднее значение (М) и стандартную ошибку среднего (m) вычисляли с помощью программного обеспечения Microsoft Excel (Microsoft, США). Для сравнения независимых выборок применяли непараметрические методы (непараметрическая статистика). Достоверность различий между исследуемыми параметрами определяли с помощью программного обеспечения Statistica 6.0 (StatSoft, США) с использованием U-критерия Манна – Уитни. Уровень значимости достоверности различий был принят 95% (р<0,05). Данные представлены в виде M±m.

    Результаты

    Были выполнены анализ экспрессии белков, связанных с ремоделированием ВКМ, и оценка площади αSMA(+)-фибробластов. Площадь окрашивания αSMA( + )-зон, свидетельствующих об активности ОАФ, в опухоли была выше в 4 раза, по сравнению с хориоидеей (p<0,0005)(рис. 1, таблица). Уровни экспрессии коллагена I типа были на 76,5% выше (p<0,005) в постэкваториальной зоне хориоидеи по сравнению с УМ (рис. 2, таблица). При оценке экспрессии ФН (FN1) было выявлено, что уровень экспрессии данного белка был выше в образцах УМ в 4,6 раза (p<0,00005) по сравнению с хориоидеей (рис. 2, таблица). Образцы опухоли также отличались высокой экспрессией MMPs и тканевого ингибитора MMPs по сравнению с хориоидеей (рис. 3): экспрессия MMP2 – на 57% (p<0,05) , MMP14 – на 62% (p<0,005) и TIMP2 – в 2 раза (p<0,05) (таблица).

    Обсуждение

    ОАФ представляют собой гетерогенные популяции мезенхимальных клеток, которые продуцируют компоненты ВКМ [4]. ОАФ в гомеостатических условиях характеризуются низкой пролиферативной активностью. Опухолевые клетки могут стимулировать активацию фибробластов с помощью факторов роста – трансформирующего фактора роста β, фактора роста тромбоцитов, эпидермального фактора роста, фактора роста соединительной ткани и др. Активированные ОАФ продуцируют различные компоненты ВКМ (преимущественно коллагеновые волокна) и MMPs, тем самым управляя процессами ремоделирования матрикса и способствуя канцерогенезу. Ключевым маркером активации ОАФ является αSMA (альфа-гладкомышечный актин) [4]. Известно, что помимо ОАФ αSMA может экспрессироваться на поверхности гладкомышечных клеток сосудов, однако при УМ разрастание сосудистой сети происходит за счет образования мелких кровеносных сосудов, которым свойственно отсутствие гладкомышечных клеток [7]. В данном исследовании при анализе образцов постэкваториальной зоны хориоидеи отмечалось αSMA( + )-окрашивание преимущественно вдоль крупных кровеносных сосудов, в то время как в интратуморальной зоне опухоли окрашивались стромальные клетки. Таким образом, высокое содержание αSMA( + )-зон в опухоли может предположительно свидетельствовать о высокой функциональной активности ОАФ.

    Интерстициальный матрикс представляет собой совокупность коллагеновых волокон, ФН, гиалуроновой кислоты, эластина и других макромолекул, основной функцией которых является поддержание и регуляция функций стромальных и иммунных клеток [15]. Интерстициальный матрикс составляет бóльшую часть стромы и играет важную роль в миграции клеток, клеточной адгезии, ангиогенезе и репарации тканей [15], кроме того, он тесно связан с БМ, опосредующей функции защитного барьера и передачи сигналов и факторов от опухолевых клеток к компонентам ВКМ [16]. Основными белками ВКМ являются коллагены, которые составляют примерно 90% стромы. Известно, что преобладающими типами коллагена в БМ являются коллагены типа IV и VIII, тогда как в ИМ – коллагены типа I, II, III, V,XI, XXIV, XXVII [16]. Различные протеогликаны, такие как декорин, бигликан и гиалектаны, удерживают фибриллы вместе, образуя коллагеновые волокна. Ключевым структурным компонентом стромы хориоидеи является коллаген I типа [17], который активно участвует в таких процессах, как заживление ран и поддержание структурной целостности ткани, однако его роль в канцерогенезе неоднозначна. Было показано повышение содержания волокон коллагена I типа, в частности, при раке молочной железы. ОАФ под влиянием различных факторов, секретируемых опухолевыми клетками, продуцируют коллагеновые волокна, что способствует развитию опухолевого фиброза (десмоплазии) [18].

    При контактном взаимодействии опухолевых клеток с коллагеном может происходить регуляция сигнальных путей, способствующих пролиферации опухолевых клеток, эпителиально-мезенхимальному переходу и метастазированию [18]. С другой стороны, во многих типах рака коллаген в тканях может выступать в роли физического барьера, препятствуя распространению факторов роста и цитокинов, тем самым снижая скорость инвазии и метастазирования [19]: было выявлено, что в таких опухолях ОАФ секретируют высокие уровни MMPs, которые разрушают коллагеновые волокна [9]. Выявленное в данном исследовании снижение экспрессии коллагена I типа согласуется с данными предыдущих исследований [20, 21] и может свидетельствовать о повышении процессов деградации ВКМ.

    Другим важным структурным компонентом ВКМ является ФН – гликопротеин, который экспрессируется ОАФ. ФН образует фибриллярную сеть и играет ключевую роль в дифференцировке, адгезии и миграции клеток [10]. Сборка ФН в ВКМ происходит при связывании с белками-интегринами, что приводит к накоплению ФН на поверхности клеток. Данный процесс способствует формированию сайтов связывания с другими компонентами ВКМ, например, коллагенами, ламининами и другими белками, позволяя опухолевым клеткам прикрепляться к ВКМ и участвовать в сигнальных каскадах, направленных на ангиогенез, инвазию и метастазирование. Было показано, что сверхэкспрессия ФН ассоциирована с канцерогенезом и ведет к развитию устойчивости к терапии путем блокирования апоптоза, вызванного противоопухолевыми препаратами [22]. Нами было выявлено значимое повышение уровней экспрессии ФН в опухоли, что может быть связано с активными процессами ремоделирования ВКМ для облегчения метастазирования, поскольку при многих типах рака сверхэкспрессия ФН ассоциирована с метастатическим распространением опухолевых клеток и плохим исходом для пациентов [23].

    Ремоделирование ВКМ происходит преимущественно за счет регуляции продукции MMPs, основным источником которых являются ОАФ. В зависимости от структуры и субстратной специфичности MMPs подразделяются на 6 основных подгрупп: коллагеназы, желатиназы, стромолизины и MMPs мембранного типа. MMPs, способные расщеплять тройные спирали коллагена I типа, основного компонента матрикса во многих тканях, включают в себя коллагеназы (MMP1, MMP8, MMP13), желатиназу А (MMP2) и ММР мембранного типа 1 (ММР14) [24]. MMP2 активируется при канцерогенезе и является ведущей протеиназой, разрушающей ВКМ для облегчения инвазии. Известно, что сверхэкспрессия MMP2 при УМ была связана с более высоким риском метастазирования [9]. Тканевые ингибиторы матриксных металлопротеиназ (TIMPs) регулируют активность ММРs путем формирования нековалентных комплексов, тем самым ограничивая разрушение тканей. Известно, что в нормальных условиях TIMP2 ингибирует ММР2 [25], однако показано, что при развитии рака TIMP2 может активировать ММР2 для активации процессов деградации интерстициального матрикса [26]. Кроме того, известно, что ФН может стимулировать ОАФ, продуцировать MMP2 для деградации коллагена I типа и облегчения инвазии [27].

    ММР14 продуцируется во многих опухолях, в том числе и при УМ. В отличие от других ММРs, ММР14 имеет мембранный домен и экспрессируется на поверхности опухолевых клеток и ОАФ в виде димера [28]. ММР14 способствует деградации коллагена: ее потенциальными мишенями являются коллагены различного типа, но основными – коллагены типа I, II и III, однако ключевой функцией ММР14 является активация ММР2 [29]. Было показано, что образование комплекса ММР14-ММР2-TIMP2 активирует ММР2 и стимулирует деградацию коллагеновых волокон и ремоделирование ВКМ – для усиления процессов ангиогенеза и метастазирования опухоли [30]. Была выявлена корреляция экспрессии MМР14 со степенью злокачественности меланомы [26]. В данной работе отмечались высокие уровни экспрессии как ММРs, способствующих разрушению коллагена (ММР2, ММР14), так и тканевого ингибитора ММР2 – TIMP2, что, вероятно, связано с активными процессами деградации ВКМ.

    Заключение

    В результате проведенного исследования выявлено значимое повышение площади αSMA( + )зон в опухоли, что может быть связано с высокой функциональной активностью ОАФ. Показано снижение уровней экспрессии коллагена I типа. Исследованные образцы опухоли характеризовались высокими уровнями экспрессии белков, ассоциированных с деградацией ВКМ, – фибронектина, ММР14, ММР2 и TIMP2. Таким образом, полученные результаты могут свидетельствовать об активном процессе ремоделирования ВКМ, что может оказывать влияние на инвазивную способность и метастазирование опухолевых клеток и требует дальнейшего исследования.

    

    Информация об авторах

    Анастасия Юрьевна Шатрук, младший научный сотрудник, anastasiashatruk@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0003-0870-1592 Наталия Петровна Бгатова, д.б.н., профессор, зав. лабораторией ультраструктурных исследований, n_bgatova@ngs.ru, https://orcid. org/0000-0002-4507-093X

    Владислав Русланович Мун, врач-офтальмолог, moon_vlad@mail. ru, https://orcid.org/0009-0005-6723-3057

    Алена Викторовна Еремина,к.м.н., врач-офтальмолог, научный сотрудник, sci@mntk.nsk.ru, https://orcid.org/0000-0002-6913-0925

    Александр Николаевич Трунов, д.м.н., профессор, руководитель научного отдела ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, Новосибирский филиал, главный научный сотрудник «ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины», trunov1963@yandex. ru, https://orcid.org/0000-0002-7592-8984

    Валерий Вячеславович Черных,д.м.н., профессор, директор ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минз-драва России, Новосибирский филиал, rimma@mntk.nsk.ru, https:// orcid.org/0000-0002-7623-3359

    Юлия Сергеевна Таскаева, к.м.н., старший научный сотрудник, inabrite@yandex.ru, https://orcid.org/0000-0002-2812-2574

    Information about the authors

    Аnastasiya Yu. Shatruk, Junior Research Assistant, anastasiashatruk@ yandex.ru, https://orcid.org/0000-0003-0870-1592

    Natalia P. Bgatova, Doctor of Sciences in Biology, Professor, Head of the Ultrastructural Research Laboratory, n_bgatova@ngs.ru, https://orcid. org/0000-0002-4507-093X

    Vladislav R. Moon, Ophthalmologist, moon_vlad@mail.ru, https://orcid. org/0009-0005-6723-3057

    Alena V. Yeremina, PhD in Medicine, Ophthalmologist, Research assistant, sci@mntk.nsk.ru, https://orcid.org/0000-0002-6913-0925

    Alexandr N. Trunov, Doctor of Sciences in Medicine, Professor, Head of the scientific department S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, Novosibirsk branch, Chief Researcher of the Federal Research Center for Fundamental and Translational Medicine, trunov1963@yandex. ru, https://orcid.org/0000-0002-7592-8984

    Valerii V. Chernykh, Doctor of Sciences in Medicine, Professor, Director of Novosibirsk branch of S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution, rimma@mntk.nsk.ru, https://orcid.org/0000-0002-7623-3359

    Yuliya S. Taskaeva, PhD in Medicine, Senior Researcher, inabrite@yandex. ru, https://orcid.org/0000-0002-2812-2574

    Вклад авторов в работу:

    А.Ю. Шатрук: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, статистическая обработка данных, написание текста.

    Н.П. Бгатова: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, статистическая обработка данных.

    В.Р. Мун: сбор, анализ и обработка материала.

    А.В. Еремина: сбор, анализ и обработка материала.

    А.Н. Трунов: редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    В.В. Черных: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, редактирование, окончательное утверждение версии, подлежащей публикации.

    Ю.С. Таскаева: существенный вклад в концепцию и дизайн работы, сбор, анализ и обработка материала, написание текста, редактирование.

    Authors’ contribution:

    А.Yu. Shatruk: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of material, statistic data processing, writing.

    N.P. Bgatova: significant contribution to the concept and design of the work, statistic data processing.

    V.R. Moon: collection, analysis and processing of material.

    A.V. Yeremina: collection, analysis and processing of material.

    A.N. Trunov: editing, final approval of the version to be published.

    V.V. Chernykh: significant contribution to the concept and design of the work, editing, final approval of the version to be published.

    Yu.S. Taskaeva: significant contribution to the concept and design of the work, collection, analysis and processing of material, writing, editing.

    Финансирование: Работа выполнена в рамках государственного задания НИИКЭЛ – филиал ИЦиГ СО РАН (№ NFWNR-2022-0012).

    Согласие пациента на публикацию: Письменного согласия на публикацию этого материала получено не было. Он не содержит никакой личной идентифицирующей информации.

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Funding: The work was completed as a government assignment of Laboratory of ultrastructural research, Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology – branch of the Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences.

    Patient consent for publications: No written consent was obtained for the publication of this material. It does not contain any personally identifying information.

    Conflict of interest: There is no conflict of interest.

    Поступила: 26.04.2024

    Переработана: 10.06.2024

    Принята к печати: 10.07.2024

    Originally received: 26.04.2024

    Final revision: 10.06.2024

    Accepted: 10.07.2024