Рис. 1. Структура биоматериала
Рис. 2. Атомно-силовая микроскопия биоматериала «Гиаматрикс» (технология получения: фотохимическое наноструктурирование)
Механизмы патологического процесса и реакций организма при ожогах глаз настолько сложны и разнообразны, что применяемые средства терапии далеко не всегда купируют развитие активного ожогового процесса [8]. Установлено, что растворы щелочей, омыляя жиры и жироподобные вещества клеточных мембран, проникают в тело клетки, изменяя рН клеточного вещества, приводят к растворению (колликвации) белков, разрушают клетку и проникают глубоко в ткани [2, 4, 5, 11].
Щелочной ожог роговицы вызывает дестабилизацию уровня гликозаминогликанов оптических сред глаза и сыворотки крови, выражающуюся в изменении их фракционного состава, при этом наблюдается активация реакций глюкуронидной конъюгации в тканях органа зрения, наиболее выраженная в переднем отрезке глаза [9]. Иной механизм воздействия оказывают растворы кислот, вызывая некроз конъюнктивы и роговицы с коагуляцией белков, что предотвращает распространение детергента вглубь тканей [2, 8, 11].
При ожоговой болезни глаз нередко происходит отторжение и некроз трансплантата вследствие нарушения микроциркуляции собственной поврежденной ткани, развития в организме иммунологического конфликта, формирования васкуляризованных бельм [3-5, 10].
Следовательно, разработка медикаментозных и хирургических методов оптимизации репаративной регенерации роговицы после химических ожогов является одним из факторов успешного лечения данной патологии.
Цель
Рис. 3. Глаз кролика на четвертые сутки после щелочного ожога (опытная группа)
Рис. 4. Глаз кролика на седьмые сутки после щелочного ожога (опытная группа)
Материал и методы
Наноструктурированный биопластический материал «Гиаматрикс» представляет собой биополимер гиалуроновой кислоты в виде плёнки толщиной 0,3-0,5 мм (рис. 1, 2). Он разработан в научно-производственной лаборатории клеточных технологий Оренбургского государственного университета и предназначен для восстановления дефектов кожных покровов [1], разрешен к применению в общей и пластической хирургии (регистрационное удостоверение ФСР 2011/10313 от 18.03.2011 г.).
Экспериментальное моделирование химического ожога роговицы проведено на 36 кроликах (72 глаз).
В первой серии эксперимента на 36 глазах 18 экспериментальных животных моделировали щелочной ожог роговицы. После чего животных разделили на две группы: опытную (18 правых глаз) и контрольную (18 левых глаз).
В опытной группе проводили аппликацию биопластического материала «Гиаматрикс» по оригинально разработанной методике (Патент на изобретение № 2485919 от 12.04.2012 г.). После стандартной обработки операционного поля, проведения эпибульбарной анестезии (Sol. Inocaini 0,4% 3-кратно), веки фиксировали векорасширителем.
Рис. 5 . Фрагмент роговицы кролика № 20 через 7 суток эксперимента. Эпителиальный регенерат. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Ув. об. 40, ок. 10
Рис. 6. Бокаловидная клетка эпителия конъюнктивы в зоне химического ожога. Кролик № 34 (III серия), стадия: 7 суток. Электронограмма. Ув. ?20500
«Гиаматрикс» трепаном выкраивали диск диаметром 10 мм. Затем «Гиаматрикс» укладывали на поверхность роговицы, смачивали физиологическим раствором для улучшения эластических свойств биоматериала и накрывали мягкой контактной линзой, которую фиксировали двумя перекидными швами.
В контрольной группе закладывали глазной гель Солкосерил. В обеих группах проводили инстилляции 0,3%-ного раствора Ципромеда.
Во второй серии формировали кислотный ожог роговицы средней степени тяжести (18 кроликов, 36 глаз). Далее в опытной группе проводили аппликацию биопластического материала по описанной выше методике (18 глаз), а в контрольной группе – закладывание глазного геля Солкосерил (18 глаз).
Клиническое исследование включало биомикроскопию переднего отрезка глаз с динамической оценкой состояния конъюнктивы, роговицы и глубже лежащих сред; флуоресцеиновую пробу.
На сроках 3, 7, 14, 30 и 90 суток животных выводили из эксперимента методом передозировки наркоза (3-разовых доз хлороформа).
Для проведения светооптического и иммуноцитохимического исследований энуклеированные глазные яблоки фиксировали в растворе нейтрального формалина, подвергали макромикроскопическому препарированию, затем промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин, выполняли серии меридиональных гистологических срезов с применением окраски гематоксилин-эозином. Изучение ультратонких срезов и их фотографирование проводили на электронном микроскопе ЭМВ 100АК при увеличении от ?8000 до ?40000.
Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные антитела с целью обнаружения клеток экспрессии белков р53 и bcl2, участвующих в инициации апоптоза и выявлении интернуклеосомальной фрагментации ДНК. Во всех случаях подсчитывали процент окрашенных клеток в случайно выбранных полях зрения.
Рис. 7. Лимфоидная инфильтрация стромальных компонентов роговицы. Кролик № 36 (III серия), стадия: 7 суток. Фиксация: спирт-формол. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Ув. об. 8, ок. 10.
Рис. 8. Фибробласт в зоне химического ожога роговицы. Кролик № 36 (III серия), стадия: 7 суток. Электронограмма. Ув. х26000
Щелочной ожог сопровождался признаками роговичного синдрома: блефароспазмом, светобоязнью, слезотечением. Клиническое исследование показало, что воздействие 2,5%-ного раствора гидрооксида натрия приводило к формированию эрозии роговицы в виде круга диаметром до 7 мм, что сопровождалось признаками реактивного воспаления: отеком и инъекцией конъюнктивы. Применение биопластического материала «Гиаматрикс» способствовало эпителизации раневого дефекта у всех животных опытной группы к 4 суткам (рис. 3), на сроке 7 суток в области воздействия щелочи отмечали нежное поверхностное помутнения (рис. 4), в то время как в контрольной группе дефект сохранялся до 7 суток. Так же было отмечено, что признаки асептического воспаления в опытной группе проходили на трое суток раньше, чем в контрольной группе.
Морфологически в зоне роговицы, подверженной действию щелочи, отмечали гибель и десквамацию клеток переднего эпителия роговицы, фрагментацию и исчезновение клеток стромы. Исследование конъюнктивы показало, что ток крови резко замедлялся, в мелких сосудах формировались тромбы, плазма выходила в окружающие ткани, что сопровождалось резким отеком конъюнктивы. Следует отметить, что характер морфологических изменений тканей глаза в условиях некроза, вызванного химической травмой, был сходным (относительно воздействия кислот и щелочей).
Существенным являлось то обстоятельство, что по мере усиления эрозивного процесса (поздние сроки наблюдений) в живых (сохранных в гистологическом отношении тканях), прилежащих к некротизированным, возникало выраженное реактивное воспаление. Оно характеризовалось вазодилатацией кровеносных сосудов, экстравазацией плазмы и форменных элементов крови с формированием демаркационной зоны (рис. 5).
Анализ серийных гистологических препаратов показал, что демаркационная линия в исследованных участках глаза была выражена слабо, а в лимбальной зоне она отсутствовала. Это приводило к утяжелению и прогрессированию некротических процессов эпителиальных и соединительнотканных структур.
В переднем эпителии роговицы и эпителии слизистой оболочки конъюнктивы отмечались грубые повреждения, завершающиеся десквамацией эпителиоцитов и обнажением базальной мембраны. Одновременно усиливалась секреция слизь-продуцирующих элементов (бокаловидные клетки конъюнктивального эпителия) (рис. 6).
При этом альтерация тканей роговицы не сопровождалась адекватными экссудативной (сосудистой) и продуктивной (пролиферативной) реакциями, что свидетельствовало о сохранении дистрофических процессов в моделируемых условиях. Таким образом, фокус воспаления в связи с процессами экссудации не в полной мере выполняет дренажную и элиминативную функции при ожоговой травме роговицы.
Преобладающее большинство эмигрирующих лейкоцитов составили сегментоядерные нейтрофилы. Помимо них, значительно реже экстравазации подвергались лимфоциты, моноциты, базофильные гранулоциты и эозинофилы. Данные клетки продвигались в зону повреждения роговицы между волокнистыми структурами по направлению к центру воспаления, где и наблюдалось их наибольшее скопление (рис. 7).
В области повреждения роговицы и прилежащих участков конъюнктивы, по мере угасания воспалительного процесса, происходила активизация камбиальных клеток и клеток фибробластического дифферона (рис. 8). При этом образовывались волокнистые структуры без разрастаний эпителиальной ткани.
Исследование показало, что травматическое (химическое) повреждение роговицы экспериментальных животных приводило к развитию некротического воспаления. Исход альтеративного воспаления зависел от глубины поражения и повреждения тканей глаза (по срокам наблюдений) и, как правило, заканчивался рубцеванием посттравматического дефекта.
Рис. 9. Глаз кролика через 1 минуту после кислотного ожога (опытная группа)
Рис. 10. Глаз кролика через 1 мин. после флюоресцеиновой пробы (опытная группа) УДК 617.713-089.843-003.93-092.9
Воздействие кислоты (3%-ный раствор уксусной кислоты) на неизмененную роговицу приводило к поверхностному помутнению (рис. 9), но инстилляция 0,1%-ного раствора флюоресцеина натрия показала, что ткань стромы не прокрашивалась, а следовательно эпителиальный покров был сохранен (рис. 10). Однако гистологически выявляли коагуляционный некроз эпителия без отторжения уплотненного струпа. В процессе лечения некротизированные ткани отторгались и на более поздних сроках исследования флуоресцеиновая проба становилась положительной. Клинически было показано, что применение «Гиаматрикса» способствовало более раннему уменьшению отека роговицы и признаков реактивного воспаления по сравнению с контрольной группой, помутнение в опытной группе рассасывалось к 14 суткам, в то время как в контроле – к 30 суткам.
Морфологическое исследование глаз на сроке 3-х суток как опытной, так и контрольной групп пока зало, что клетки переднего эпителия роговицы были повреждены; в мелких сосудах конъюнктивы формировались тромбы. Кроме деструктивных изменений эпителиоцитов, отмечались нарушения в строме, которые строго соответствовали участку ожога и захватывали не менее 1/3 толщины стромы. В период с 7 по 14 сутки в опытной группе уже наблюдали переход экссудативной фазы воспаления в пролиферативную, в контрольной группе этот процесс был выявлен только к концу месяца.
Иммуноцитохимическое исследование показало, что при применении биопластического материала снижалась апоптотическая доминанта эпителиоцитов и фибробластов роговицы, взятой для исследования на третьи и четырнадцатые сутки эксперимента. С другой стороны, возрастала экспрессия синтеза протеина bcl2, что свидетельствовало о выраженности пролиферативной фазы воспаления, это подтверждало результаты световой микроскопии. Таким образом, иммуноцитохимическое исследование показало, что аппликация «Гиаматрикса» оптимизировала репаративные гистогенезы с включением механизмов лимитирования экспрессии проапоптатического гена p53, уменьшение иммунопозитивных эпителиоцитов в 2,5-3 раза по сравнению с контрольной группой
Выводы
Аппликация биопластического материала на роговицу на начальных этапах лечения повреждений роговицы (щелочной и кислотный ожог) уменьшает выраженность отека и гиперемии и, как следствие, сокращает экссудативную фазу воспаления.
В результате клинико-функционального анализа особенностей течения щелочного повреждения роговицы установлено, что применение «Гиаматрикса» ускоряет закрытие дефекта роговицы в 1,5 раза быстрее по сравнению с контрольной группой.
Применением биоматериала в исходе кислотного ожога за счет сокращения экссудативной фазы воспаления ускоряет рассасывание помутнений роговицы по сравнению с применением глазного геля Солкосерил.
