Появление фемтосекундных лазеров, создающих с помощью сфокусированных кавитационных пятен гладкие разрезы в строме и однородные крышки, расширяет возможности хирурга и обеспечивает высокие функциональные результаты при выполнении рефракционной операции [1, 8]. Фемтосекундный лазер «IntraLase FS» (Intralase Corp., США) использует близкий инфракрасный луч света, чтобы точно отделить ткани с помощью процесса, называемого фоторазрывом, когда лазерные импульсы разделяют ткани на молекулярном уровне без передачи тепла или воздействия на окружающие ткани [1]. В отличие от эксимерлазерной абляции, фоторазрыв не зависит от свойств абсорбции длины лазерного излучения тканью роговицы. В основе фоторазрыва лежит явление, называемое индуцированный лазерный оптический распад, который завершается, когда строго сфокусированный лазерный импульс ультракороткой продолжительности (600-800 фсек) производит плазму. Плазма медленно расширяется со сверхзвуковой скоростью, постепенно замещая окружающие ткани шоковыми волнами. После охлаждения плазмы формируется полость пузыря, при этом испаряется маленький участок ткани (менее 1 микрона), а оставшийся пузырь эвакуируется с помощью эндотелиального насоса или при поднятии крышки. Программное обеспечение позволяет выполнить резекционную плоскость, которая создается размещением десятков тысяч смежных лазерных импульсов в секунду, в любом направлении [1, 9].
Основанием к проведению данного исследования была отмеченная нами на фоне прекрасных клинических результатов более выраженная воспалительная реакция в первый день после LASIK с использованием фемтосекундного лазера для резекции крышки и заметное рубцевание по краю крышки в отдаленном послеоперационном периоде, что соответствовало наблюдениям других авторов [6, 9].
Цель исследования — анализ раннего послеоперационного заживления раны в роговице кролика после воздействия фемтосекундного лазера «IntraLase FS 60 кГц» (Intralase Corp., США).
Материал и методы
Для исследования использовались 7 взрослых кроликов породы шиншилла весом 2,5-3 кг. Анестезия — кетамин внутримышечно, инокаин — местно. Эвтаназия на 6 день после операции. На 1 глазу у всех кроликов после фиксации вакуумом и установки аппланационного конуса был сделан разрез роговичной крышки фемтосекундным лазером «IntraLase FS» с частотой повторения импульсов 60 кГц, длиной волны 1053 нм, в режиме растер, диаметром пятна 5-6 мкм, энергией 1,5 мкДж и диаметром крышки 8,8 мм. Было создано 2 плоскости разреза – горизонтальная на глубину 120 мкм и вертикальная под углом 70° к поверхности роговицы. Крышка после операции не поднималась. Второй глаз использовался для контроля. Энергетические параметры, использованные в исследовании, были рекомендованы производителем. После операции закапывали дексаметазон и тобрамицин 3 раза в день.
Для гистологического и электронно-микроскопического анализа роговицу отделяли от глаза и фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на 0,1М фосфатном буфере (pH — 7,2-7,4). Фиксированный материал промывали фосфатным буфером и постфиксировали 2% раствором осмиевой кислоты (OsO4) в течение суток. Материал промывали 50% этанолом, контрастировали 2% водным раствором уранил ацетата, затем дегидратировали в этаноле возрастающей концентрации (70, 96%), ацетоне и пропилен оксиде. Обезвоженный материал заключали в эпоксидную смолу (Эпон 812) и полимеризовали при 60°С. После этого приготавливали «полутонкие» срезы толщиной 3-5 мкм, прикрепляли их к предметным стеклам, окрашивали метиленовым синим, затем заключали в эпоксидную смолу (Эпон 812) и просматривали в световом микроскопе. После идентификации зоны облучения, препараты фотографировали, изготавливали ультратонкие срезы, контрастировали и просматривали в цифровом электронном микроскопе «Hitachi–500» (Japan). Фотографировали все слои роговицы в зоне воздействия и в интактных участках. Отдельно фотографировали клетки в контрольных роговицах, не подвергшихся облучению.
Результаты
Рис. 1. Световой микроснимок роговицы на 6-й день после воздействия фемтосекундного лазера 60 кГц: А – гиперплазированный эпителий в зоне бокового разреза; Б – эпителиальная пробка, на границе которой определяются концы обрезанных коллагеновых волокон стромы (головки стрелок); горизонтальный разрез (стрелки) (окраска метиленовым-синим х200)
Рис. 2. Трансмиссионный электронный микроснимок эпителия в месте бокового разреза: А – поверхностные клетки расположены в один слой; Б – крыловидные клетки увеличены в размере, отечны; межэпителиальные контакты расширены, десмосомы выражены слабо (стрелка) (х3000)
На световых микроснимках во всех образцах роговицы на 6-е сутки после операции горизонтальный разрез едва заметно контурируется. В месте бокового (вертикального) разреза эпителий гиперплазирован, отечен, на краю сформированной крышки по ходу разреза вглубь на 120-110 мкм в строме определяется выраженная эпителиальная пробка, плотно контактирующая с поперечно обрезанными концами коллагеновых фибрилл стромы (рис. 1).
На трансмиссионных электронных микроснимках роговицы в зоне бокового воздействия по краю крышки определяется выраженная воспалительная инфильтрация, вызванная деструктивными изменениями после воздействия фемтосекундного лазера. Эпителий утолщен, в верхних слоях отмечается упорядоченное расположение отечных, отличающихся полиморфизмом поверхностных клеток в 1-2 слоя и крыловидных клеток более чем в 3 слоя. Межэпителиальные промежутки расширены, десмосомы в соединительном межклеточном пространстве крыловидных клеток выражены слабо (рис. 2). Базальные клетки имеют цилиндрическую форму, отличаются полиморфизмом, отечны, внутри их цитоплазмы наблюдается перинуклеарная микровакуолизация, межклеточные пространства увеличены. В основании базальных клеток наблюдается выраженное скопление полиморфно-ядерных лейкоцитов. Базальная мембрана обычных размеров идентифицируется практически на всем протяжении эпителиально-стромальной границы за исключением небольшого участка, где ход ее прерывается. Ниже базальная мембрана граничит с обрывками разрыхленных коллагеновых волокон, соприкасающихся с активно делящимися, мигрировавшими в разрез эпителильными клетками (рис. 3). Содержимое эпителиальной пробки представлено в меньшей степени продуктами деструкции клеток стромы, и в основном мигрировавшими эпителиальными клетками, расположенными плотно по краю разрезанных волокон, с кистовидными, незаполненными полостями в центре (рис. 4). Ниже в строме рядом с поперечно обрезанными концами фибрилл определяются множественные активированные кератоциты (кератобласты) с обширным резервуаром ретикулярной ткани (рис. 5). На электронном микроснимке в зоне горизонтального разреза роговицы определяются некротические клеточные отложения со случайным разрывом клеточных органелл в несколько расширенных межклеточных пространствах между непрерывными коллагеновыми фибриллами (рис. 6). Выше, в строме, определяются единичные кератобласты. Эпителий и субэпителиальный слой над горизонтальным разрезом не изменены и соответствуют контрольной норме. Эндотелий и прилегающая к нему строма роговицы в области бокового и горизонтального разрезов не изменены и соответствуют контролю. В контрольных роговицах данных изменений нет.
Обсуждение
Рис. 3. Трансмиссионный электронный микроснимок базального эпителия (А) на границе с остатками стромальных коллагеновых фибрилл (Б) в месте бокового разреза: скопление лейкоцитов (стрелка), базальная мембрана (М) с выраженными полудесмосомами, место прерывистости базальной мембраны (головка стрелки) (х3000)
Рис. 4. Трансмиссионный электронный микроснимок в зоне эпителиальной пробки: мигрирующие поверхностные и крыловидные клетки (х3000)
Выполненные рядом авторов исследования особенностей заживления стромальной раны после использования микрокератома показали, что в месте разреза преобладает апоптоз клеток [2, 5]. Воздействие же фемтосекундного лазера на ткани, по заключению других исследователей, вызывает некроз клеток и следующую за этим выраженную воспалительную реакцию. При этом отмечается отсутствие значимых различий между фемтосекундным лазером 60 кГц и микрокератомом в вызванной инфильтрации и стромальной пролиферации клеток по всему разрезу, по сравнению с предыдущими моделями лазеров 15 и 30 кГц, кроме бокового воздействия на периферии [4]. Считается, что более сильная реакция заживления по краю крышки способствует биомеханической стабильности роговицы и значительно уменьшает риск смещения крышки в послеоперационном периоде [1, 4, 8].
Проведенный в нашем исследовании ультраструктурный анализ образцов показал наличие в тканях роговицы фотодеструктивных изменений, индуцированных воздействием фемтосекундного лазера. Эти изменения проявлялись по-разному в зависимости от места воздействия. В горизонтальном срезе в местах скоплений некротических клеток воспалительная реакция была минимальной, и одно из объяснений этому – отсутствие существенных повреждений коллагеновых фибрилл. В боковом разрезе помимо коллагеновых фибрилл повреждался еще и эпителий, клетки которого, как известно, постоянно производят про-воспалительные цитокины, освобождающиеся при его повреждениях [3]. Большие количества цитокинов, высвобождаясь в стромальную рану, связываются с рецепторами кератоцитов и увеличивают воспалительную инфильтрацию клеток [3, 7]. Следует отметить, что исследованиям изменений, вызванных лазерным воздействием и реакцией заживления роговицы, всегда мешали различия между роговицами животных и людей. Из образцов, доступных для лабораторной работы, только роговицы обезьян и микросвиней имеют боуменову оболочку, и у животных всегда наблюдается более агрессивная реакция заживления раны [7].
Рис. 5. Трансмиссионный электронный микроснимок в месте бокового разреза: А – концы разрезанных коллагеновых фибрилл стромы; Б – эпителиальные клетки; С – некротические клетки и обрывки волокон; К – кератобласты в строме (х3500)
Рис. 6. Трансмиссионный электронный микроснимок в месте горизонтального разреза: некротические отложения в строме по ходу горизонтального разреза между коллагеновыми фибриллами (стрелка) (х8000)
Возможно, меньшие энергетические уровни воздействия и усовершенствование фемтосекундных лазеров приведут к менее выраженной воспалительной инфильтрации по ходу разреза. Тем не менее, именно эта реакция способствует лучшей адгезии крышки роговицы и усиливает биомеханическую стабильность роговицы [6, 9].
Выводы
1. Ультраструктурный анализ исследований показал, что в клетках эпителия и соединительно-тканной стромы роговицы наблюдаются фотодеструктивные изменения, индуцированные облучением фемтосекундного лазера, которые проявляются по-разному в разных местах воздействия.
2. Наиболее выраженные изменения наблюдаются в области бокового воздействия, что обусловлено повреждением коллагеновых волокон стромы и эпителия в месте разреза.
3. Эпителий и субэпителиальный слой над горизонтальным разрезом, ход волокон по всему разрезу и эндотелий роговицы вместе с прилежащей соединительнотканной стромой роговицы не повреждаются.
Поступила 25.06.08
