Актуальность
Рисунок 1. Изображения микроорганизмов, полученных с помощью СЭМ (BSE). Окраска BioREE-B, масштабный отрезок равен 2 мкм: а) Чистая культура Pseudomonas aeruginosa; б) Чистая культура Mycobacterium abscessus; в) Импрессионая проба пациента с кератитом. Смешанная колония микроорганизмов.
Таблица 1 Распределение изображений в зависимости от разрешения по каждому из видов
Диагностических ошибок в верификации микробиального окружения ГП могла бы позволить избежать визуальная информативная экспресс-методика. Подобным методом может стать сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) с лантаноидным контрастированием. Однако, как и любой другой «визуальный» диагностический метод, основанная на СЭМ методика требует формального сравнения с эталоном: то есть описания и систематизации фенотипических признаков уже известных микроорганизмов для построения диагностического алгоритма. До сих пор не существовало подобного каталога изображений, полученных с применением этих методик.
Цель и задачи исследования
Целью нашего исследования является создание атласа изображений эталонных культур микроорганизмов, образцы которых были контрастированы лантаноидами с последующим получением изображений на СЭМ. Основная задача – формальное описание характерных признаков, возникающих при использовании лантаноидного контрастирования и присущих наиболее распространенным патогенным и симбионтным микробам ГП на материале эталонных культур.
Материал и методы
На основании литературных данных о наиболее распространенных микроорганизмов ГП в норме и при патологии [1–5] был выбран перечень видов микроорганизмов для визуализации: Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii, Bacillus cereus, Burkholderia cepacia, Corinebacterium difthereae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Moraxella catarhhalis, Pseudomonas aeruginosa, Rothia mucilaginosa, Salmonella enterica, Serratia marcescens, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus pneumoniae, Candida albicans, Pneumocystis jirovecii, Mycobacterium abscessus.
Клетки из колоний микробных культур суспендировали в растворе Хенкса без фенолового красного в концентрации, соответствующей 1,0 ед. оптической плотности по шкале МакФарланда. По 0,1 мл суспензии наносили на диски из полистирола (диаметр 7 мм). Подготовленную таким образом пробу естественно подсушивают в течение 2 мин. в стерильных условиях для обеспечения адгезии клеток на поверхности. Сразу же после этого носитель с адгезированными микробными клетками обрабатывается реактивами из набора для контрастирования BioREE-B в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя (ООО «Глаукон», Россия). Фиксации и обезвоживанию образцы не подвергались. Образцы препаратов после лантаноидного контрастирования закрепляли на предметном столике микроскопа посредством адгезивной углеродной ленты (Nisshin EM, Co., Япония) и размещали в камере сканирующего электронного микроскопа (EVO LS 10, Zeiss, Germany). Наблюдение проводится в режиме низкого вакуума при ускоряющем напряжении 20-21 кВ и токе на образце 60-320 пА. Использовали детектор обратно-рассеянных электронов (BSE). Далее полученные изображения микроорганизмов использовали для составления иллюстраций атласа и поиска консервативных признаков с целью выделения морфологических кластеров и групп.
Для иллюстрации работы с определителем мы взяли импрессионную пробу у пациента с инфекционным кератитом, используя гибкое пластиковое покровное стекло, которое апплицировали на ГП. Образец подготовили, используя реактивы из набора для контрастирования BioREE-B, и визуализировали на сканирующем электронном микроскопе.
Результаты и обсуждение
Получено 527 изображений в двух принятых увеличениях (табл. 1).
Были проанализированы специфические морфологические признаки микроорганизмов. Основным конституциональным признаком, позволяющим разделить микроорганизмы на группы, оказалась форма микроорганизмов (сферическая, палочковидная или промежуточная). Для разделения групп на подгруппы мы использовали характеристики контура микроорганизма: его очертания и контрастность по отношению к фону. Также учитывались такие признаки, как наличие спор, очертания жгутиков, подвижность микроорганизмов. В результате на основании перечисленных признаков была построена рубрикация атласа-определителя (табл. 2).
На рис. 1а (сплошная стрелка) представлено изображение чистой культуры Pseudomonas aeruginosa – палочковидных бактерий с умеренным удлинением без образования спор с четкими контурами внешних оболочек. На рис. 1б (прерывистая стрелка) представлено изображение чистой культуры Mycobacterium abscessus – экстремально удлиненных нитевидных бактерий.
Соответствующие признаки выделенных морфологических групп уточняются, но уже можно говорить о возможности уверенного дифференциального определения высших заданных нами таксонов (царства). Предварительный анализ говорит о том, что удовлетворительная диагностика, проведенная с помощью нашего классификатора, возможна и в более мелких таксонах, вплоть до ранга рода или кластеров, объединяющих несколько родов.
Достижение многообразия отличительных признаков микроорганизмов определяется тем, что в отличие от классической СЭМ, где большинство микроорганизмов выглядят одинаково, лантаноидное контрастирование при СЭМ существенно увеличивает информативность получаемых изображений. При пробоподготовке с использованием неодима (одного из лантаноидов) клетка сохраняет свою форму и целостность мембраны [6]. Хорошо визуализируются стенки бактериальных клеток, межклеточные перегородки, связанные с делением, контакты между клетками, взаимоотношения в кластерах. Изображения бактерий и грибов при СЭМ с лантаноидным контрастированием часто демонстрируют родоспецифичные: форму, паттерн контрастирования и другие признаки [7].
Обнаруженные при создании атласа специфичные признаки в дальнейшем могут применяться на практике для интерпретации отпечатков с глазной поверхности, выполняемых при проведении импресионной пробы (рис. 1в). А импрессионные пробы, наоборот – мотивировать на расширение перечня эталонных изображений. Например, выделенные при визуализации чистых культур признаки оказались сопоставимы с признаками микроорганизмов в импрессионных пробах пациентов с кератитом. Так, на рис. 1в видно, что в пробе пациента с кератитом визуализируется смешанная колония, состоящая из микроорганизмов группы III, подгруппы III.2) (рис. 1в, сплошная стрелка) и микроорганизмов группы V (рис. 1в, прерывистая стрелка). В группу V могут входить микроорганизмы родов Mycobacterium и Actinobacteria, эталонные изображения последних еще предстоит добавить в базу. Несмотря на неполноту, уже сейчас пользуясь фенотипической рубрикацией атласа, можно сузить перечень предполагаемых инфекционных агентов и подтвердить анализы, выполненные другими методами.
Заключение
Высокая ожидаемая востребованность атласа-определителя в офтальмологии определяется возможностью быстро провести исследование биологического материала импрессионной пробы посредством СЭМ с лантаноидным контрастированием. Мы ожидаем, что атлас с иллюстрациями эталонных культур, наиболее часто встречающихся микроорганизмов на ГП, станет первым шагом для внедрения данной методики в качестве экспресс-диагностики.
