Несмотря на различие этиологических факторов в основе развития целого ряда патологий сетчатки, таких как возрастная макулярная дегенерация, диабетическая и посттромботическая ретинопатия, ретинопатия недоношенных и т.д., лежат процессы патологического ангиогенеза, которые развиваются в результате дисбаланса между про-ангиогенными (VEGF — сосудисто-эндотелиальный фактор роста, FGF – фактор роста фибробластов, ангиогенин, интерлейкин 8) и антиангиогенными (ангиостатин, эндостатин, PEDF — фактор пигментного эпителия, PF4 — фактор тромбоцитов 4) факторами.
На сегодняшний день перспективы проведения коррекции аномального ангиогенеза связаны, в основном, с группой препаратов (Луцентис, Авастин), являющихся блокаторами ангиогенного стимулятора — сосудисто-эндотелиального фактора роста — VEGF, т.е. только одного из звеньев антогонистической системы.
Для достижения же необходимого эффекта, в такой системе необходимо наличие динамического баланса. Одним из представителей наиболее активных ингибиторов ангиогенеза является фактор пигментного эпителия (pigment epithelium-derived factor – PEDF) [3, 4, 6].
PEDF — белок с молекулярной массой 50 килоДальтон, относится к классу серпинов, ингибиторов сериновых протеаз [8, 9]. Синтезируется в клетках пигментного эпителия сетчатки [11], содержится в высоких концентрациях в интерфоторецепторном матриксе и стекловидном теле, в более низких — в роговице, хрусталике и внутриглазной жидкости [9, 10, 11].
Безусловный интерес PEDF представляет еще и в связи с тем, что он обладает нейротрофическим действием. Он поддерживает нормальное развитие фоторецепторов и экспрессию в них зрительного пигмента после гибели пигментного эпителия сетчатки [5], оказывает нейропротективное действие на фоторецепторы сетчатки при световом [2] и глутаматном повреждении [7], обладает способностью поддерживать выживание ретинальных нейронов после вызванной перекисью водорода гибели клеток in vitro [1].
Однако для того, чтобы оценить перспективы и возможность применения этого фактора в клинической офтальмологии, необходимо проведение дальнейших экспериментальных исследований, направленных на изучение влияния PEDF на состояние сетчатки. В настоящее время в качестве экспериментальных моделей ряда патологий широко используются различные типы клеточных и тканевых культур. Наиболее перспективными для проведения исследований являются органотипические культуры сетчатки, обладающие следующими преимуществами: сохранность цитоархитектоники; отсутствие нейро-гуморальных воздействий; возможность создать модель, максимально соответствующую поставленным задачам.
Цель работы — изучение влияния рекомбинантного PEDF и Авастина на состояние органотипических культур сетчатки.
Материал и методы
В работе было использовано 90 эксплантатов сетчатки семидневных крыс: 30 эксплантатов культивировали с PEDF (из них 5 эксплантатов использовали для проведения Вестернблот анализа), 30 — культивировали с Авастином (из них 5 эксплантатов использовали для проведения Вестерн-блот анализа), 30 эксплантатов входили в группу контроля (из них 5 эксплантатов использовали для проведения Вестерн-блот анализа).
Изолированные глаза крыс промывали в 70% этиловом спирте и в двух сменах стерильного фосфатного буфера (DPBS; «Sigma»). Сетчатку выделяли в охлажденном DPBS, содержащем 0,8% глюкозы (G1 — DPBS). Цельную сетчатку промывали раствором антибиотиков и помещали в культуральную чашку с полной питательной средой (DMEM⁄F12 с добавлением цитокинов, антибиотиков и 5% сыворотки).
Цельные эксплантаты культивировали в прикрепленном виде в чашке Петри диаметром 30 мм.
Культивирование проводили в инкубаторе во влажной камере при температуре +37 °С и содержании углекислоты 5% в культуральной среде DMEM⁄F12 (1:1) с добавлением цитокинов, антибиотиков и 5% эмбриональной телячьей сыворотки. Смену среды производили каждые 2-3 суток.
PEDF добавляли в среду в концентрации 0,5 μg⁄ml, а Авастин – 50 μg⁄ml. Эффективность этой концентрации была определена предварительно в экспериментах с культивацией клеток сетчатки и определением их жизнеспособности. Контролем служили эксплантаты, культивируемые без PEDF и Авастина.
Культивирование производили в течение 30 суток, далее образцы фиксировали и хранили в забуференном растворе антифриза до окрашивания антителами.
Во время эксперимента состояние эксплантатов и поведение клеток контролировали ежедневно с помощью микроскопа с фазовым контрастом. Для оценки жизнеспособности клеток эксплантата использовали акридиновый оранжевый, который окрашивает живые клетки и пропидий йодистый, который окрашивает ядерную ДНК гибнущих клеток.
По окончании эксперимента эксплантаты промывали фосфатным буфером и фиксировали 4% раствором параформальдегида в физиологическом растворе с добавлением 0,01 молярного фосфатного буфера при рН=7,4 в течение 20 минут при 4 °С. После промывания фиксированных прикрепленных эксплантатов в фосфатном буфере дно культуральной чашки просушивали и эксплантаты с выселившимися клетками окружали гидрофобной полоской, после чего проводили их иммуногистохимическую окраску. Для этого использовали метод непрямого иммуногистохимического окрашивания с использованием коктейля моноклональных мышиных антител к маркеру коммитированных нейробластов — β-III-тубулину в разведении 1:100 (Chemicon, MAB 1637) и поликлональных кроличьих антител к маркеру глиальных клеток — кислому глиальному фибриллярному белку — GFAP в разведении 1:80 (Sigma, G9269). Реакцию с первичными антителами проводили в течение 12 часов при 4 °С. После промывки в фосфатном буфере, эксплантаты покрывали смесью вторичных антител к иммуноглобулину кролика, меченых Техасским красным (красное свечение при зеленом освещении) и антител к иммуноглобулину мыши, меченых Су 2 (зеленое свечение при синем освещении), оба в разведении 1:100.
Для анализа антиангиогенных свойств был проведен Вестерн-блот анализ. Для этого использовали эксплантаты, культивируемые с PEDF, Авастином и эксплантаты из группы контроля. Метод основывается на определении количества экспрессируемого фактора фон-Виллебранда, который синтезируется в эндотелиальных клетках, являясь внутриклеточным протеином, специфичным для данного типа клеток. Для проведения метода приготавливали клеточные лизаты опытных и контрольных образцов при помощи Reporter Lysis Buffer. После обработки лизирующим раствором чашки помещали в жидкий азот на несколько секунд, а потом в термостат при +37 °С на 10 мин. Полученный лизат центрифугировали и наносили на полиакриламидный гель (ПААГ) с раствором для прокрашивания:
50 мМ Tris (PH=6,8) .............1 мл
50% глицерин..........................5 мл
15% SDS ........................................1,5 мл
15 β-меркаптоэтанол.........1,5 мл
0,01% ВРВ....................................1 мл
Для переноса на мембрану использовали режим переноса 2 мА⁄см² (стабилизация по току) 2 часа и напряжение не более 20В. Затем мембрану окрашивали Ponceau Red 3-5 минут на шейкере, чтобы проконтролировать наличие белка на мембране. Затем отмывали мембрану в буфере TBST 3 раза по 5 минут. Мембрану инкубировали с первичными поликлональными антителами (anti-von Willibrand Faktor; разведение 1:1000) в 15 мл TBST ночь при +4 °С. Затем мембрану отмывали 15 минут в TBST буфере 2 раза по 10 минут на шейкере. После этого мембрану инкубировали с вторичными антителами (antirabbit, конъюгированные с пероксидазой хрена; разведение 1:10000) 1,5 мл на 15 мл TBST ночь при +4 °С. Мембрану промывали в 20 мл TBST (15 минут два раза по 10 минут на шейкере). Белки визуализировали с использованием ECL-набора по инструкции производителя (GE Healthcare). Правильность нанесения порций белка на дорожки контролировали при помощи визуализации актина на мембране. Мембрану инкубировали с первичными антителами (actin c-2; разведение 1:1000) по методике, описанной выше. Затем со вторичными антителами (антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена; в разведении 1:10000) и проявляли по методике, описанной выше.
Результаты и обсуждение
Рис. 1-2. 14-й день культивирования с PEDF (стрелками указаны отростки нейронов, выходящие за пределы эксплантата)
Рис. 3. 14-й день культивирования – контроль (стрелками указаны глиальные элементы)
Рис. 4. 14-й день культивирования с Авастином (стрелками указаны единичные клетки с морфологией нейронов и единичные отростки нейронов)
В течение первых 5-7 суток культивирования происходило оседание и распластывание эксплантатов сетчатки по дну культуральной чашки; небольшое количество клеток выселялось из эксплантата на дно. При проведении исследования в фазовом контрасте на данном этапе эксплантаты сетчатки при культивировании с PEDF и Авастином и без них по внешнему виду и по количеству выселившихся на дно клеток не отличались.
На 14-й день культивирования происходило дальнейшее выселение клеток из эксплантата на дно культуральной чашки и их расселение по значительной территории. При исследовании в фазовом контрасте в эксплантатах, культивируемых с PEDF, начинали формироваться многочисленные длинные отростки, выходящие за пределы эксплантатов (рис. 1-2). В контроле и в культурах с Авастином наблюдались глиальные клетки, единичные клетки с морфологией нейронов (рис. 3, 4) и единичные отростки нейронов.
Рис. 5-6. 21-й день культивирования с PEDF (стрелками указаны выселившиеся нейроны и их отростки)
Рис. 7. 21-й день культивирования – контроль (многочисленные глиальные клетки)
Рис. 8. 21-й день культивирования с Авастином (многочисленные глиальные клетки)
На 17-е и, особенно, на 21-е сутки культивирования продолжалось выселение клеток из эксплантата на дно чашки. В эксплантатах, культивируемых с PEDF, происходило дальнейшее увеличение числа отростков, их длины и разветвленности, происходило формирование новой сети из выселившихся нейронов (рис. 5-6). В контроле и в культурах с Авастином происходило в основном выселение глиальных клеток, наблюдались единичные клетки с морфологией нейронов и единичные отростки нейронов (рис. 7-8).
На 30-е сутки культивирования в зоне расселения клеток из эксплантатов, культивируемых с PEDF, образовывались пучки сильно разветвленных отростков, длина которых значительно больше, чем на 21 сутки. В этих эксплантатах было обнаружено большое количество GFAPиммунонегативных — βIII-тубулин иммунопозитивных клеток с аксоноподобными тубулин-позитивными отростками, распространяющимися за пределы тела эксплантата и образующими разветвленную сеть (рис. 9-10). За пределами эксплантата волокна распространялись по поверхности выселившихся клеток, но за зону их распространения не выходили. Образование обширных сетей отростков вне эксплантата наблюдалось в местах наибольшей плотности выселившихся клеток. Наличие экспрессии βIII-тубулина свидетельствует о принадлежности данных клеток к нейрональному ряду. В контроле происходило расселение GFAP-позитивных клеток. Клетки, экспрессирующие βIII-тубулин, в контроле и в культурах, культивируемых с Авастином, были выявлены только в глубине эксплантатов в небольшом количестве. При этом аксоноподобные βIII-тубулин позитивные отростки были очень тонкие, определялись только в теле эксплантата и очень редко выходили за его пределы, в отличие от опыта (рис. 11-12).
Рис. 9-10. 30-е сутки культивирования с PEDF (белыми стрелками указаны β-III-тубулин позитивные клетки, голубыми – аксоноподобные тубулин-позитивные отростки)
Рис. 11. 30-е сутки культивирования – контроль (белыми стрелками указаны аксоноподобные β-III-тубулин-позитивные отростки в теле эксплантата, голубыми – выселившиеся GFAP-позитивные клетки)
Рис. 12. 30-е сутки культивирования с Авастином (белыми стрелками указаны аксоноподобные β-III-тубулин-позитивные отростки в теле эксплантата, голубыми – выселившиеся GFAP-позитивные клетки)
По результатам анализа клеток сетчатки на жизнеспособность на 30-е сутки в эксплантатах, культивируемых без PEDF, было выявлено наличие обширных очагов клеточной гибели как внутри, так и на поверхности эксплантатов (рис. 13). В эксплантатах, культивируемых с PEDF, очаги клеточной гибели были значительно меньше (рис. 14). Очаги клеточной гибели в культурах, культивируемых с Авастином, были меньше по сравнению с контролем, но больше, чем в культурах с PEDF (рис. 15).
При проведении Вестерн-блот анализа была установлена идентичная ширина полос тестового белка — актина во всех опытах, что говорит о правильности проведения исследования. Кроме этого, выявлено, что в контроле экспрессия фактора фон-Виллибранда в 2 раза выше, чем при действии PEDF и Авастина, о чем свидетельствует ширина вторых полос на полученных результатах, характеризующих количество исследуемого белка (рис. 16).
Заключение
Рис. 13. Оценка жизнеспособности – контроль (красным цветом окрашены очаги клеточной гибели, зеленым – живые клетки)
Рис. 14. Оценка жизнеспособности – PEDF (красным цветом окрашены очаги клеточной гибели, зеленым – живые клетки)
Рис. 15. Оценка жизнеспособности – Авастин (красным цветом окрашены очаги клеточной гибели, зеленым – живые клетки)
Рис. 16. Вестерн– блот анализ
Установлено, что по сравнению с Авастином и контролем в органотипических культурах сетчатки крысы при культивировании с PEDF увеличивается жизнеспособность клеток сетчатки; развивается активная клеточная миграция и активный рост βIII-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы, выходящих за пределы эксплантата. Можно предположить, что эти тонкие аксоноподобные отростки являются регенирирующими аксонами выживших после эксплантации ганглиозных клеток.
Выявлено, что в культурах сетчатки, культивируемых с PEDF и Авастином, экспрессия фактора фон-Виллибранда значительно меньше, чем без них. Полученные данные подтверждают наличие у фактора пигментного эпителия выраженных антиангиогенных свойств, которые сопоставимы по степени выраженности с Авастином.
Таким образом, фактор пигментного эпителия (PEDF) обладает выраженными нейропротективными и нейротрофическими свойствами, а также имеет мощную антиангиогенную активность.
Поступила 06.11.08
Работа выполнена при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 08-04-00881-а, 07-04-12120-офи, 07-04-00835-а) и Госконтрактом № 02.512.11.2224 от 4 июля 2008 г.
