Рис. 1. Конфокальная микроскопия роговицы кролика, 1 группа. Визуализируется гиперрефлективная зона со снижением плотности клеточных элементов вокруг
Рис. 2. Группа 2. Роговица кролика с визуализирующимся ложем интракорнеальной линзы. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 50
Путь развития кераторефракционных операций лежал от биологических гомотрансплантатов [1, 5] к аллотрансплантатам из полимерных материалов, в качестве которых использовались лейкосапфир, различные виды пластмасс, силикон, полиметилметакрилат (ПММА) и др. [4, 7]. Отрицательные результаты экспериментальных исследований биосовместимости интрастромальных линз из непроницаемых материалов (лейкосапфир, полисульфон и др.) привели к необходимости создания изделий для внутрироговичной имплантации с учетом таких факторов, как проницаемость, диаметр, толщина линзы и глубина ее залегания [8, 13]. Сегодня на международном рынке апробированы и доступны к клиническому применению такие модели инлаев, как InVue (Neoptics AG, Hunenberg, Швейцария), Flexivue Microlens (Presbia, Los Angeles, США; Presbia Cooperatief, U.A., Amsterdam, Нидерланды), Kamra (AcuFocus, Ирвин, США), Raindrop (Revision Optics, Lake Forest, США), сконструированные с учетом перечисленных факторов [9, 14-16]. С использованием технических возможностей и производственных мощностей отечественных производителей были смоделированы и изготовлены внутрироговичные линзы (инлаи) выпукло-вогнутой формы диаметром 2 мм толщиной 50 мкм из гидроксиэтилметакрилата (ГЕМА) (ООО «НЭП МГ») и олигоуретанметакрилата (ОУМА) (ООО «Репер-НН»).
Цель – провести доклиническое исследование биосовместимости разработанных внутрироговичных линз из современных полимерных материалов (ГЕМА и ОУМА) в экспериментальном исследовании in vivo и электронно-микроскопическом исследовании.
Задачи:
1. Изучить в сравнительном аспекте изменение гистоморфологических параметров роговицы кролика после имплантации разработанных внутрироговичных инлаев, изготовленных из ГЕМА и ОУМА.
2. Изучить в сравнительном аспекте особенности поверхности разработанных внутрироговичных инлаев, изготовленных из ГЕМА и ОУМА и форму их края.
Материал и методы
Рис. 3. Роговица кролика. Визуализируется ход сформированного роговичного кармана с утолщением эпителия над ним. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 50
Рис. 4. Сканирующая электронная микроскопия внутрироговичной линзы, изготовленной из ГЕМА. Край линзы неровный, сравнительно толстый
При моделировании эксперимента на животных учитывался факт наличия у кроликов тонких (400 мкм) и больших в диаметре (15 мм) роговиц. Операции проводились под общей анестезией с иммобилизацией животных пеленанием. С помощью кератотомического ножа с микроподачей выполняли насечку, отступя 1 мм от лимба, на глубину 200 мкм, с последующим механическим расслаиванием средних слоев стромы роговицы прямым ножом-расслаивателем, формируя роговичный карман. Инлаи имплантировались в сформированное роговичное ложе, швы не накладывались. На парном глазу формировался роговичный карман, сравнимый с выполненным в опытной группе, без имплантации линзы.
На сроке наблюдения 3 мес. выполняли прижизненную конфокальную микроскопию на приборе ConfoScan 4 (Nidek, Япония) с последующим выведением животных из эксперимента для исследования энуклеированных глаз с помощью метода световой микроскопии. При этом материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Выполняли серии гистологических срезов с применением окраски гематоксилин-эозином. Препараты изучались под микроскопом фирмы Leica DM LВ2 с камерой DFC 320 при 50-, 100-, 200-, 400-кратном увеличении с последующим фотографированием. Морфологические исследования выполнены на базе лаборатории патологической анатомии и гистологии глаза (зав. лабораторией – к.м.н. Шацких А.В.).
Материалом для проведения электронно-микроскопического исследования послужили интактные внутрироговичные линзы, изготовленные из ГЕМА (1 линза) и ОУМА (1 линза). Разработанные изделия фиксировались к столику с помощью карбонового скотча с последующим напылением золотом. Полученные образцы изучались с помощью электронно-ионного микроскопа «Quanta 200 3D» (FEI Company, США). Сканирующая электронная микроскопия выполнялась на базе лаборатории анатомии микроорганизмов ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи.
Результаты
Рис. 5. Сканирующая электронная микроскопия внутрироговичной линзы, изготовленной из ОУМА. Край линзы ровный, сравнительно тонкий
Таблица Гистоморфологические параметры роговицы кролика, определяемые методом световой микроскопии
При проведении прижизненной конфокальной микроскопии в 1 группе (2 глаза) и 2 группе (2 глаза) отмечалась активация кератоцитов, визуализировались единичные волокна коллагена, имплантированная линза определялась в виде гиперрефлективной зоны в средних слоях стромы роговицы со снижением плотности клеточных элементов вокруг (рис. 1), задний эпителий во всех глазах опытных групп оставался интактным. В 1 группе (2 глаза) отмечалась неполная прозрачность экстрацеллюлярного матрикса вокруг имплантата. В группе 3 (4 глаза) визуализировалась незначительная активация кератоцитов, которая являлась следствием нанесения операционной травмы. Другие слои роговицы оставались интактными.
При проведении световой микроскопии, как видно на рис. 2, в 1 группе (2 глаза) и 2 группе (2 глаза) визуализировалось ложе инлая. Вокруг ложа в обеих группах выявлялась активация клеток, предположительно собственных кератоцитов. Эпителий и эндотелий – без видимых изменений в зоне расположения инлая и вне этой зоны. В 3 группе (4 глаза) на всех препаратах – без значительных изменений во всех слоях роговицы. На рис. 3 визуализируется линия вреза (ход сформированного роговичного кармана) окруженная разреженной стромой с утолщением эпителия над ним (табл.).
На рис. 4 и 5 представлена сканирующая электронная микроскопия поверхности и края интактных линз из ГЕМА и ОУМА, на которой визуализируется гладкая поверхность без видимых зазубрин, впадин или выступающих над остальной поверхностью линзы участков. Однако, при исследовании в сравнительном аспекте формы края разработанных изделий, у внутрироговичных линз из ГЕМА визуализировался неровный, зазубренный край, что, возможно, связано с техническими особенностями изготовления разработанных изделий. При этом у линз из ОУМА форма края была ровная, без видимых зазубрин. Обнаруженная нами особенность краевой поверхности разработанных изделий, возможно, является причиной обнаружения в 1 группе неполной прозрачности экстрацеллюлярного матрикса вокруг имплантата при выполнении конфокальной микроскопии.
Заключение
Таким образом, при проведении доклинического исследования биосовместимости внутрироговичных линз из современных полимерных материалов (ГЕМА и ОУМА) в экспериментальном исследовании in vivo и электронно-микроскопическом исследовании, было выявлено, что разработанные изделия не вызывают выраженного клеточного и тканевого ответа роговицы кролика, визуализируемого методами прижизненной конфокальной и световой микроскопии. Однако неровная, зазубренная форма края изделий, изготовленных из ГЕМА, обусловленная, по-видимому, технически более сложной технологией изготовления («точение»), может вызывать несколько большую активацию клеток вокруг ложа роговицы и умеренное уплотнение стромы вокруг линзы, в сравнении с изделиями, изготовленными из ОУМА.
