Сравнительный анализ влияния растворов рибофлавина на толщину роговицы кроликов

    Актуальность

    Кератоконус (КК) представляет наиболее частую по распространенности кератоэктазию, имеющую хронический и преимущественно двусторонний характер дегенеративного поражения роговой оболочки. В основе патогенеза данной офтальмопатологии лежит нарушение коллагеновой структуры роговицы, что приводит к ее истончению и уменьшению прочности. Именно поэтому роговица деформируется, теряет прозрачность, вследствие чего ухудшаются и зрительные функции.

    Традиционные терапевтические и хирургические мероприятия при КК заключались в использовании жестких контактных линз, интрастромальных сегментов или колец, глубокой послойной или сквозной пересадки роговицы. В 2003 г. в клиническую практику вошел новый метод лечения кератоэктазий – ультрафиолетовый кросслинкинг роговицы (УФКР), сочетающий ультрафиолетовое (УФ) облучение типа А (370 нм) и местное применение 0,1% раствора рибофлавина, выполняющего роль фотосенсибилизатора (ФС) и протектора ультрафиолета. Показано, что УФКР положительно влияет на биомеханику роговицы, повышая ее прочность, способствует остановке прогрессирования заболевания за счет образования в структуре роговичного коллагена дополнительных межмолекулярных химических связей, индуцированных фотохимическими реакциями при участии активных форм кислорода [1–5].

    Как известно, большое значение при УФКР придается толщине роговицы, которая в классическом исполнении (стандартный Дрезденский протокол) должна быть не меньше 400 мкм после деэпителизации. Это позволяет избежать неблагоприятного воздействия цитотоксической дозы ультрафиолета на задний эпителий роговицы [6]. Вместе с тем нередко в результате прогрессирования кератоэктазии толщина роговицы прогрессивно уменьшается, ограничивая показания к выполнению процедуры. Однако и в этом случае, как правило, самым обоснованным способом лечения хронического эктатического процесса остается метод УФКР.

    С целью задействовать безопасное применение УФКР у пациентов с «тонкой» роговицей были предложены трансэпителиальный, ускоренный (акселерированный), импульсный клинические протоколы [5]. Для дополнительной защиты структур роговицы в процессе УФ-облучения стали применяться специальные контактные линзы или донорские лентикулы. Кроме того, рекомендовалось изменять концентрацию ФС, дополнительно добавлять в раствор пенетраторы (бензалкония хлорид и др.) для трансэпителиальной доставки рибофлавина или полимеры для улучшения его диффузии в строму роговой оболочки [7].

    Также одной из технологий УФКР является применение гипотонического раствора ФС, индуцирующего отек стромы и увеличение толщины роговицы [8]. Это расширяет показания к применению УФКР при тонкой роговице. По мнению доктора F. Hafezi [9], нижним пределом толщины стромы при УФКР с гипотоничным раствором ФС должна являться величина, не превышающая 330 мкм.

    При этом ряд исследователей главной отрицательной стороной выбора такой методики считают недостаточную эффективность УФКР [10, 11], и только в единичных сообщениях указывается на такое осложнение, как снижение числа клеток эндотелия роговицы [12].

    Цель

    Изучить влияние изотоничности растворов рибофлавина на толщину роговицы в эксперименте.

    Материал и методы

    В исследования, одобренные Этическим комитетом учреждения, включены 9 кроликов (18 глаз) породы шиншилла. Животные были разделены на 3 группы в зависимости от применяемого состава ФС. В двух группах использовали изотонические растворы 0,1% рибофлавина мононуклеотида (далее по тексту рибофлавина) в составе: с 1,0% гидроксипропилметилцеллюлозой (ГПМЦ) (1-я группа), с физраствором (2-я группа). В 3-й группе применяли раствор 0,1% рибофлавина на гипотонической основе, разработанный в Уфимском НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России [12, 13].

    Исследования выполняли в операционной вивария под общим наркозом («Ксилазин» 20 мг/кг и «Золетил» 15 мг/кг, внутримышечно) и местной инстилляционной анестезией (глазные капли «Инокаин»). Под контролем операционного микроскопа шпателем производили деэпителизацию роговицы на участке, отмеченном метчиком диаметром 9 мм. Закапывания исследуемых растворов рибофлавина на роговицу проводили в течение 60 мин со следующим интервалом: в 1-й группе с частотой 1 капля в 2 мин, во 2-й и 3-й – из расчета 1 капля в 1 мин [14].

    У кроликов определяли прижизненную толщину роговицы с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ) (Vizante OCT, Германия) в 3 точках: в центре и в 3 мм от него. Измерения осуществляли каждые 5 мин в продолжение 1 ч.

    Для статистического анализа использовали пакет прикладных программ Microsoft Excel 2010 и Statistika 6.0. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

    Результаты и обсуждение 

    Важным этапом при выполнении стандартного УФКР является деэпителизация роговицы. Как известно, толщина роговичного эпителия человека в среднем составляет 51,68±4,42 мкм и находится в диапазоне 34–66 мкм [15].

    Однако при развитых стадиях КК возможно незначительное снижение толщины эпителиального слоя клеток.

    По данным H.F. Li и соавт. (1997), толщина центрального эпителия роговой оболочки кролика, измеренная прижизненно с помощью конфокальной микроскопии со сквозной фокусировкой, составляет 47,7±2,2 мкм [16], а вся роговица кролика in vivo имеет толщину 356,11±14,34 мкм [17].

    В результате проведенных нами наблюдений было установлено, что корнеальная толщина у интактных кроликов, включенных в эксперимент, была в диапазоне от 358 до 416 мкм. На рисунках 1 и 2 показаны примеры обследования роговицы кролика с помощью метода ОКТ.

    По данным ОКТ, непосредственно после удаления эпителия средняя толщина роговицы незначительно снижалась. Однако в отдельных случаях отмечали статистически не значимое увеличение показателя (от 6 до 24 мкм), что, по всей видимости, может быть вызвано погрешностью измерения или краткосрочным отеком стромы вследствие механического воздействия на роговицу на фоне инстилляций анестетика или физраствора.

    Во всех группах после деэпителизации наблюдали незначительное (на 11±3,9 мкм) снижение толщины роговицы (рис. 3).

    Измерения, проведенные в 1-й и 2-й группах через 5 и 10 мин наблюдений, указывали на постепенное восстановление толщины деэпителизированной роговой оболочки, в сравнении с дооперационными значениями. В 3-й группе, начиная с 10 мин эксперимента, отмечали тенденцию к росту показателя, очевидно, за счет реализации гипотонического эффекта раствора (рис. 3).

    В последующем с 15 мин измерений и в продолжение всего эксперимента отчетливо проявилось характерное влияние исследуемых растворов на толщину роговицы. Так, изотонические растворы при инстилляциях поддерживали относительно стабильную толщину деэптелизированной роговицы. При этом показатели в 1-й группе были незначительно ниже, очевидно, за счет содержания в растворе ГПМЦ (диапазон от 338 до 366 мкм, при толщине интактной роговицы 374±23,1 мкм). Во 2-й группе 2 наблюдалась схожая тенденция с незначительной флюктуацией толщины роговицы (диапазон 386 до 365 мкм, при толщине интактной роговицы 379±28,2 мкм). Однако в процессе инстилляции изотонических растворов статистически значимой разницы динамики изменений толщины роговицы не наблюдалось.

    В свою очередь гипотонический раствор (3-я группа) индуцировал выраженный отек стромы и демонстрировал устойчивую тенденцию к увеличению толщины роговицы до 449,6±160,4 (диапазон от 407 до 606 мкм), по сравнению с ее интактным состоянием 390,1±36,4 мкм.

    Такой отклик роговой оболочки призван обезопасить проведение УФКР у пациентов с развитой стадией кератэктазии при толщине роговицы менее 400 мкм.

    Следует отметить, что для поддержания соответствующего терапевтического эффекта производилась различная частота инстилляций растворов рибофлавина: водные – 1 капля в 1 мин, раствор с ГПМЦ – из расчета 1 капля в 2 мин. Это обусловлено тем, что последний образует устойчивую прекорнеальную пленку за счет высокой вязкости полимера, тогда как водные растворы быстрее смываются с поверхности роговицы [14].

    При использовании изотонических растворов (1-я и 2-я группы) динамика изменений толщины роговой оболочки в интервале 30–60 мин (который соответствует этапу УФ-облучения при УФКР) была стабильной и значимо не отличалась от исходного состояния деэпителизированной роговицы. При инстилляциях предложенного гипотонического раствора рибофлавина в указанный промежуток времени толщина роговицы кроликов без эпителия превышала дооперационные значения на 10,2–15,1%.

    Заключение

    Прижизненная оценка состояния роговицы кроликов в динамике при инстилляциях изотонических и гипотонического растворов рибофлавина, моделирующих процесс УФ-кросслинкинга, выявила кратковременное незначительное снижение толщины роговицы на фоне деэпителизации с последующим (20–60 мин) стабильным поддержанием показателя в диапазоне, обеспечивающем безопасное проведение хирургического вмешательства.

    При использовании гипоосмотического рибофлавина наблюдается увеличение толщины роговицы, индуцированное отеком стромы, что позволяет применять этот раствор в клинической практике у пациентов с тонкой роговицей (менее 450 мкм) под интраоперационным контролем.

    Информация об авторах

    Бикбов Мухаррам Мухтарамович, д.м.н., профессор, директор Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, https://orcid.org/0000-0002-9476-8883

    Халимов Азат Рашидович, д.б.н., заведующий научно-инновационным отделением Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, https://orcid.org/0000-0001-7470-7330

    Усубов Эмин Логман оглы, к.м.н., заведующий отделением хирургии роговицы и хрусталика Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, https://orcid.org/0000-0002-1008-1516

    Бабушкин Александр Эдуардович, д.м.н., заведующий отделом организации научных исследований и разработок Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, https://orcid.org/0000-0001-6700-0812

    Казакбаева Гюлли Мухаррамовна, к.м.н., заведующая отделением офтальмологической и медицинской эпидемиологии Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, https://orcid.org/0000-0002-0569-1264

    Низамутдинова Айгуль Маратовна, научный сотрудник отделения офтальмологической и медицинской эпидемиологии Уфимского НИИ глазных болезней ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России, https://orcid.org/0000-0003-2502-2313

    Information about the authors

    Mukharram М. Bikbov, Dr. Sci. (Med.), Professor; director, Ufa Eye Research Institute of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Bashkir State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, https://orcid.org/0000-0002-9476-8883

    Azat R. Khalimov, Dr. Sci. (Biol.), head of the scientific and innovative department, Ufa Eye Research Institute of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Bashkir State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, https://orcid.org/0000-0001-7470-7330

    Emin L. Usubov, Cand. Sci. (Med.), head of the department of corneal and lens surgery, Ufa Eye Research Institute of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Bashkir State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, https://orcid.org/0000-0002-1008-1516

    Alexander E. Babushkin, Dr. Sci. (Med.), head of the department of research and development organisation, Ufa Eye Research Institute of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Bashkir State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, https://orcid.org/0000-0001-6700-0812

    Gulli M. Kazakbayeva, Cand. Sci. (Med.), head of the department of ophthalmological and medical epidemiology, Ufa Eye Research Institute of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Bashkir State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, https://orcid.org/0000-0002-0569-1264

    Aygul M. Nizamutdinova, research associate of the department of ophthalmological and medical epidemiology, Ufa Eye Research Institute of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Bashkir State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, https://orcid.org/0000-0003-2502-2313

    Вклад авторов:

    Бикбов М.М. – концепция и дизайн исследования, консультирование.

    Халимов А.Р. – концепция и дизайн исследования, написание текста, редактирование, сбор и обработка материала.

    Усубов Э.Л. – редактирование, консультирование.

    Бабушкин А.Э. – концепция и дизайн исследования, написание текста, редактирование.

    Казакбаева Г.М. – сбор и обработка материала, консультирование.

    Низамутдинова А.М. – сбор и обработка материала.

    Authors’ contribution:

    Bikbov M.M. – concept and design of the study, consulting.

    Khalimov A.R. – concept and design of the study, writing, editing, collection and processing of the material.

    Usubov E.L. – editing, consulting.

    Babushkin A.E. – concept and design of the study, writing, editing.

    Kazakbayeva G.M. – collection and processing of the material, consulting.

    Nizamutdinova A.M. – collection and processing of the material.

    Финансирование: Исследование выполнено в рамках государственного задания на осуществление научных исследований и разработок ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России (регистрационный № 1023022300003-8-3.2.22).

    Financing: The study was performed within the framework of the state assignment for the implementation of scientific research and development FSBEI HE BSMU MOH Russia (registration No. 1023022300003-8-3.2.22).

    Конфликт интересов: Отсутствует.

    Conflict of interest: None.

    Поступила: 05.08.2024

    Переработана: 15.08.2024

    Принята к печати: 19.08.2024

    Originally received: 05.08.2024

    Final revision: 15.08.2024

    Accepted: 19.08.2024